Diagnosis banding nodul paru yang diidentifikasi dengan computerized tomography (CT) masih menjadi tantangan dalam praktik klinis.Di sini, kami mengkarakterisasi metabolisme global dari 480 sampel serum, termasuk kontrol sehat, nodul paru jinak, dan adenokarsinoma paru stadium I.Adenokarsinoma menunjukkan profil metabolik yang unik, sedangkan nodul jinak dan individu sehat memiliki kesamaan profil metabolik yang tinggi.Pada kelompok penemuan (n = 306), satu set 27 metabolit diidentifikasi untuk membedakan nodul jinak dan ganas.AUC model diskriminan pada kelompok validasi internal (n = 104) dan validasi eksternal (n = 111) masing-masing adalah 0,915 dan 0,945.Analisis jalur mengungkapkan peningkatan metabolit glikolitik terkait dengan penurunan triptofan dalam serum adenokarsinoma paru dibandingkan dengan nodul jinak dan kontrol yang sehat, dan menyarankan bahwa serapan triptofan mendorong glikolisis dalam sel kanker paru-paru.Penelitian kami menyoroti nilai biomarker metabolit serum dalam menilai risiko nodul paru yang terdeteksi oleh CT.
Diagnosis dini sangat penting untuk meningkatkan tingkat kelangsungan hidup pasien kanker.Hasil dari Uji Coba Skrining Kanker Paru Nasional AS (NLST) dan Studi NELSON Eropa menunjukkan bahwa skrining dengan tomografi komputer dosis rendah (LDCT) dapat secara signifikan mengurangi angka kematian akibat kanker paru pada kelompok risiko tinggi1,2,3.Sejak meluasnya penggunaan LDCT untuk skrining kanker paru-paru, kejadian temuan radiografi insidental berupa nodul paru tanpa gejala terus meningkat4 .Nodul paru didefinisikan sebagai kekeruhan fokal dengan diameter hingga 3 cm5 .Kami menghadapi kesulitan dalam menilai kemungkinan keganasan dan menangani sejumlah besar nodul paru yang terdeteksi secara kebetulan pada LDCT.Keterbatasan CT dapat menyebabkan seringnya pemeriksaan lanjutan dan hasil positif palsu, sehingga menyebabkan intervensi yang tidak perlu dan pengobatan yang berlebihan6.Oleh karena itu, terdapat kebutuhan untuk mengembangkan biomarker yang andal dan berguna untuk mengidentifikasi kanker paru-paru pada tahap awal dengan tepat dan membedakan sebagian besar nodul jinak pada deteksi awal7 .
Analisis molekuler darah yang komprehensif (serum, plasma, sel mononuklear darah tepi), termasuk genomik, proteomik, atau metilasi DNA8,9,10, telah meningkatkan minat terhadap penemuan biomarker diagnostik untuk kanker paru-paru.Sementara itu, pendekatan metabolomik mengukur produk akhir seluler yang dipengaruhi oleh tindakan endogen dan eksogen dan oleh karena itu diterapkan untuk memprediksi permulaan dan hasil penyakit.Kromatografi cair-spektrometri massa tandem (LC-MS) adalah metode yang banyak digunakan untuk studi metabolomik karena sensitivitasnya yang tinggi dan rentang dinamis yang besar, yang dapat mencakup metabolit dengan sifat fisikokimia berbeda11,12,13.Meskipun analisis metabolik global plasma/serum telah digunakan untuk mengidentifikasi biomarker yang terkait dengan diagnosis kanker paru-paru14,15,16,17 dan kemanjuran pengobatan,18 pengklasifikasi metabolit serum untuk membedakan antara nodul paru jinak dan ganas masih banyak dipelajari.-penelitian besar-besaran.
Adenokarsinoma dan karsinoma sel skuamosa adalah dua subtipe utama kanker paru-paru non-sel kecil (NSCLC).Berbagai tes skrining CT menunjukkan bahwa adenokarsinoma adalah jenis kanker paru-paru histologis yang paling umum1,19,20,21.Dalam penelitian ini, kami menggunakan spektrometri massa resolusi tinggi-kromatografi cair kinerja ultra (UPLC-HRMS) untuk melakukan analisis metabolomik pada total 695 sampel serum, termasuk kontrol sehat, nodul paru jinak, dan terdeteksi CT ≤3 cm.Skrining untuk adenokarsinoma paru stadium I.Kami mengidentifikasi panel metabolit serum yang membedakan adenokarsinoma paru dari nodul jinak dan kontrol sehat.Analisis pengayaan jalur mengungkapkan bahwa metabolisme triptofan dan glukosa yang abnormal merupakan perubahan umum pada adenokarsinoma paru dibandingkan dengan nodul jinak dan kontrol yang sehat.Akhirnya, kami menetapkan dan memvalidasi pengklasifikasi metabolik serum dengan spesifisitas dan sensitivitas tinggi untuk membedakan antara nodul paru ganas dan jinak yang terdeteksi oleh LDCT, yang dapat membantu dalam diagnosis banding dini dan penilaian risiko.
Dalam penelitian ini, sampel serum yang disesuaikan dengan jenis kelamin dan usia dikumpulkan secara retrospektif dari 174 kontrol sehat, 292 pasien dengan nodul paru jinak, dan 229 pasien dengan adenokarsinoma paru stadium I.Karakteristik demografis dari 695 subjek ditunjukkan pada Tabel Tambahan 1.
Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1a, total 480 sampel serum, termasuk 174 kontrol sehat (HC), 170 nodul jinak (BN), dan 136 sampel adenokarsinoma paru (LA) stadium I, dikumpulkan di Pusat Kanker Universitas Sun Yat-sen.Kelompok penemuan untuk profil metabolik yang tidak ditargetkan menggunakan kromatografi cair kinerja ultra-spektrometri massa resolusi tinggi (UPLC-HRMS).Seperti yang ditunjukkan pada Gambar Tambahan 1, metabolit diferensial antara LA dan HC, LA dan BN diidentifikasi untuk membangun model klasifikasi dan mengeksplorasi lebih lanjut analisis jalur diferensial.104 sampel yang dikumpulkan oleh Pusat Kanker Universitas Sun Yat-sen dan 111 sampel yang dikumpulkan oleh dua rumah sakit lain masing-masing menjalani validasi internal dan eksternal.
populasi penelitian dalam kohort penemuan yang menjalani analisis metabolomik serum global menggunakan kromatografi cair kinerja ultra-spektrometri massa resolusi tinggi (UPLC-HRMS).b Analisis diskriminan kuadrat terkecil parsial (PLS-DA) dari total metabolisme 480 sampel serum dari kelompok penelitian, termasuk kontrol sehat (HC, n = 174), nodul jinak (BN, n = 170), dan adenokarsinoma paru stadium I (Los Angeles, n = 136).+ESI, mode ionisasi elektrospray positif, -ESI, mode ionisasi elektrospray negatif.c – e Metabolit dengan kelimpahan berbeda secara signifikan dalam dua kelompok tertentu (uji peringkat bertanda Wilcoxon dua sisi, nilai p yang disesuaikan dengan tingkat penemuan palsu, FDR <0,05) ditampilkan dalam warna merah (perubahan lipatan > 1,2) dan biru (perubahan lipatan <0,83) .) ditampilkan pada grafik gunung berapi.f Peta panas pengelompokan hierarki menunjukkan perbedaan signifikan dalam jumlah metabolit beranotasi antara LA dan BN.Sumber data disediakan dalam bentuk file data sumber.
Total metabolisme serum 174 HC, 170 BN dan 136 LA pada kelompok penemuan dianalisis menggunakan analisis UPLC-HRMS.Kami pertama-tama menunjukkan bahwa sampel kontrol kualitas (QC) mengelompok dengan erat di tengah model analisis komponen utama (PCA) tanpa pengawasan, yang menegaskan stabilitas kinerja penelitian saat ini (Gambar Tambahan 2).
Seperti yang ditunjukkan dalam analisis diskriminan kuadrat terkecil parsial (PLS-DA) pada Gambar 1 b, kami menemukan bahwa ada perbedaan yang jelas antara LA dan BN, LA dan HC dalam mode ionisasi elektrospray positif (+ESI) dan negatif (−ESI). .terpencil.Namun tidak ditemukan perbedaan signifikan antara BN dan HC pada kondisi +ESI dan -ESI.
Kami menemukan 382 fitur diferensial antara LA dan HC, 231 fitur diferensial antara LA dan BN, dan 95 fitur diferensial antara BN dan HC (uji peringkat bertanda Wilcoxon, FDR <0,05 dan beberapa perubahan >1,2 atau <0,83) (Gambar .1c-e )..Puncak selanjutnya dijelaskan (Data Tambahan 3) terhadap database (perpustakaan mzCloud/HMDB/Chemspider) berdasarkan nilai m/z, waktu retensi dan pencarian spektrum massa fragmentasi (detail dijelaskan di bagian Metode) 22.Akhirnya, 33 dan 38 metabolit beranotasi dengan perbedaan kelimpahan yang signifikan diidentifikasi untuk LA versus BN (Gambar 1f dan Tabel Tambahan 2) dan LA versus HC (Gambar Tambahan 3 dan Tabel Tambahan 2), masing-masing.Sebaliknya, hanya 3 metabolit dengan perbedaan kelimpahan yang signifikan yang diidentifikasi dalam BN dan HC (Tabel Tambahan 2), konsisten dengan tumpang tindih antara BN dan HC dalam PLS-DA.Metabolit diferensial ini mencakup berbagai macam biokimia (Gambar Tambahan 4).Secara keseluruhan, hasil ini menunjukkan perubahan signifikan dalam metabolisme serum yang mencerminkan transformasi ganas kanker paru stadium awal dibandingkan dengan nodul paru jinak atau subjek sehat.Sementara itu, kesamaan metabolisme serum BN dan HC menunjukkan bahwa nodul paru jinak mungkin memiliki banyak karakteristik biologis yang sama dengan individu sehat.Mengingat mutasi gen reseptor faktor pertumbuhan epidermal (EGFR) sering terjadi pada adenokarsinoma paru subtipe 23, kami berusaha untuk menentukan dampak mutasi penggerak pada metabolisme serum.Kami kemudian menganalisis profil metabolik keseluruhan dari 72 kasus dengan status EGFR pada kelompok adenokarsinoma paru.Menariknya, kami menemukan profil yang sebanding antara pasien mutan EGFR (n = 41) dan pasien tipe liar EGFR (n = 31) dalam analisis PCA (Gambar Tambahan 5a).Namun, kami mengidentifikasi 7 metabolit yang kelimpahannya berubah secara signifikan pada pasien dengan mutasi EGFR dibandingkan dengan pasien dengan EGFR tipe liar (uji t, p <0,05 dan perubahan lipatan> 1,2 atau <0,83) (Gambar Tambahan 5b).Mayoritas metabolit ini (5 dari 7) adalah asilkarnitin, yang berperan penting dalam jalur oksidasi asam lemak.
Seperti yang diilustrasikan dalam alur kerja yang ditunjukkan pada Gambar 2 a, biomarker untuk klasifikasi nodul diperoleh dengan menggunakan operator penyusutan absolut terkecil dan seleksi berdasarkan 33 metabolit diferensial yang diidentifikasi dalam LA (n = 136) dan BN (n = 170).Kombinasi variabel terbaik (LASSO) – model regresi logistik biner.Validasi silang sepuluh kali lipat digunakan untuk menguji reliabilitas model.Pemilihan variabel dan regularisasi parameter disesuaikan dengan penalti maksimalisasi kemungkinan dengan parameter λ24.Analisis metabolomik global selanjutnya dilakukan secara independen dalam kelompok validasi internal (n = 104) dan validasi eksternal (n = 111) untuk menguji kinerja klasifikasi model diskriminan.Hasilnya, 27 metabolit dalam set penemuan diidentifikasi sebagai model diskriminan terbaik dengan nilai rata-rata AUC terbesar (Gambar 2b), di antaranya 9 mengalami peningkatan aktivitas dan 18 penurunan aktivitas di LA dibandingkan dengan BN (Gambar 2c).
Alur kerja untuk membangun pengklasifikasi nodul paru, termasuk memilih panel metabolit serum terbaik dalam set penemuan menggunakan model regresi logistik biner melalui validasi silang sepuluh kali lipat dan mengevaluasi kinerja prediktif dalam set validasi internal dan eksternal.b Statistik validasi silang model regresi LASSO untuk pemilihan biomarker metabolik.Angka-angka yang diberikan di atas mewakili jumlah rata-rata biomarker yang dipilih pada λ tertentu.Garis putus-putus merah mewakili nilai AUC rata-rata pada lambda yang sesuai.Bilah kesalahan berwarna abu-abu menunjukkan nilai AUC minimum dan maksimum.Garis putus-putus menunjukkan model terbaik dengan 27 biomarker terpilih.AUC, area di bawah kurva karakteristik operasi penerima (ROC).c Lipat perubahan 27 metabolit terpilih pada kelompok LA dibandingkan dengan kelompok BN pada kelompok penemuan.Kolom merah – aktivasi.Kolom biru adalah penurunan.d – f Kurva karakteristik operasi penerima (ROC) menunjukkan kekuatan model diskriminan berdasarkan 27 kombinasi metabolit dalam set validasi penemuan, internal, dan eksternal.Sumber data disediakan dalam bentuk file data sumber.
Model prediksi dibuat berdasarkan koefisien regresi tertimbang dari 27 metabolit ini (Tabel Tambahan 3).Analisis ROC berdasarkan 27 metabolit ini menghasilkan nilai area under curve (AUC) sebesar 0,933, sensitivitas kelompok penemuan adalah 0,868, dan spesifisitas adalah 0,859 (Gambar 2d).Sementara itu, di antara 38 metabolit diferensial yang dianotasi antara LA dan HC, satu set 16 metabolit mencapai AUC 0,902 dengan sensitivitas 0,801 dan spesifisitas 0,856 dalam membedakan LA dari HC (Gambar Tambahan 6a-c).Nilai AUC berdasarkan ambang perubahan lipatan yang berbeda untuk metabolit diferensial juga dibandingkan.Kami menemukan bahwa model klasifikasi memiliki kinerja terbaik dalam membedakan antara LA dan BN (HC) ketika tingkat perubahan lipatan ditetapkan ke 1,2 versus 1,5 atau 2,0 (Gambar Tambahan 7a,b).Model klasifikasi, berdasarkan 27 kelompok metabolit, selanjutnya divalidasi dalam kelompok internal dan eksternal.AUC adalah 0,915 (sensitivitas 0,867, spesifisitas 0,811) untuk validasi internal dan 0,945 (sensitivitas 0,810, spesifisitas 0,979) untuk validasi eksternal (Gbr. 2e, f).Untuk menilai efisiensi antar laboratorium, 40 sampel dari kohort eksternal dianalisis di laboratorium eksternal seperti yang dijelaskan di bagian Metode.Akurasi klasifikasi mencapai AUC 0,925 (Gambar Tambahan 8).Karena karsinoma sel skuamosa paru (LUSC) adalah subtipe kanker paru non-sel kecil (NSCLC) kedua yang paling umum setelah adenokarsinoma paru (LUAD), kami juga menguji potensi kegunaan profil metabolik yang tervalidasi.BN dan 16 kasus LUSC.AUC diskriminasi antara LUSC dan BN adalah 0,776 (Gambar Tambahan 9), yang menunjukkan kemampuan yang lebih buruk dibandingkan diskriminasi antara LUAD dan BN.
Penelitian telah menunjukkan bahwa ukuran nodul pada gambar CT berkorelasi positif dengan kemungkinan keganasan dan tetap menjadi penentu utama pengobatan nodul25,26,27.Analisis data dari studi skrining NELSON kohort besar menunjukkan bahwa risiko keganasan pada subjek dengan kelenjar getah bening <5 mm bahkan serupa dengan risiko pada subjek tanpa kelenjar getah bening28.Oleh karena itu, ukuran minimum yang memerlukan pemantauan CT rutin adalah 5 mm, seperti yang direkomendasikan oleh British Thoracic Society (BTS), dan 6 mm, seperti yang direkomendasikan oleh Fleischner Society 29 .Namun, nodul yang lebih besar dari 6 mm dan tanpa gambaran jinak yang jelas, yang disebut nodul paru tak tentu (IPN), tetap menjadi tantangan utama dalam evaluasi dan penatalaksanaan dalam praktik klinis30,31.Kami selanjutnya memeriksa apakah ukuran nodul memengaruhi tanda metabolik menggunakan sampel yang dikumpulkan dari kelompok penemuan dan validasi internal.Berfokus pada 27 biomarker yang divalidasi, pertama-tama kami membandingkan profil PCA dari metabolom HC dan BN sub-6 mm.Kami menemukan bahwa sebagian besar titik data untuk HC dan BN tumpang tindih, menunjukkan bahwa kadar metabolit serum serupa pada kedua kelompok (Gambar 3a).Peta fitur pada rentang ukuran yang berbeda tetap dilestarikan dalam BN dan LA (Gambar 3b, c), sedangkan pemisahan diamati antara nodul ganas dan jinak dalam kisaran 6-20 mm (Gambar 3d).Kelompok ini memiliki AUC 0,927, spesifisitas 0,868, dan sensitivitas 0,820 untuk memprediksi keganasan nodul berukuran 6 hingga 20 mm (Gbr. 3e, f).Hasil kami menunjukkan bahwa pengklasifikasi dapat menangkap perubahan metabolik yang disebabkan oleh transformasi ganas dini, terlepas dari ukuran nodul.
iklan Perbandingan profil PCA antara kelompok tertentu berdasarkan pengklasifikasi metabolik 27 metabolit.CC dan BN <6 mm.b BN <6 mm vs BN 6–20 mm.di LA 6–20 mm versus LA 20–30 mm.g BN 6–20 mm dan LA 6–20 mm.KPK, n = 174;BN < 6 mm, n = 153;BN 6–20 mm, n = 91;LA 6–20 mm, n = 89;LA 20–30 mm, n = 77. e Kurva karakteristik pengoperasian penerima (ROC) menunjukkan kinerja model diskriminan untuk nodul 6–20 mm.f Nilai probabilitas dihitung berdasarkan model regresi logistik untuk nodul berukuran 6–20 mm.Garis putus-putus berwarna abu-abu menunjukkan nilai batas optimal (0,455).Angka-angka di atas mewakili persentase kasus yang diproyeksikan di Los Angeles.Gunakan uji t Student dua sisi.PCA, analisis komponen utama.Area AUC di bawah kurva.Sumber data disediakan dalam bentuk file data sumber.
Empat sampel (berusia 44-61 tahun) dengan ukuran nodul paru yang serupa (7-9 mm) selanjutnya dipilih untuk menggambarkan kinerja model prediksi keganasan yang diusulkan (Gambar 4a, b).Pada pemeriksaan awal, Kasus 1 terlihat sebagai nodul padat dengan kalsifikasi, suatu gambaran yang berhubungan dengan sifat jinak, sedangkan Kasus 2 terlihat sebagai nodul padat sebagian yang tidak dapat ditentukan tanpa gambaran jinak yang jelas.Tiga putaran CT scan tindak lanjut menunjukkan bahwa kasus-kasus ini tetap stabil selama periode 4 tahun dan oleh karena itu dianggap sebagai nodul jinak (Gambar 4a).Dibandingkan dengan evaluasi klinis CT scan serial, analisis metabolit serum tunggal dengan model pengklasifikasi saat ini dengan cepat dan benar mengidentifikasi nodul jinak ini berdasarkan batasan probabilistik (Tabel 1).Gambar 4b pada kasus 3 menunjukkan nodul dengan tanda retraksi pleura, yang paling sering dikaitkan dengan keganasan32.Kasus 4 disajikan sebagai nodul padat sebagian yang tidak dapat ditentukan dan tidak ada bukti penyebab jinak.Semua kasus ini diperkirakan bersifat ganas berdasarkan model pengklasifikasi (Tabel 1).Penilaian adenokarsinoma paru ditunjukkan melalui pemeriksaan histopatologi pasca operasi reseksi paru (Gambar 4b).Untuk set validasi eksternal, pengklasifikasi metabolik secara akurat memperkirakan dua kasus nodul paru tak tentu yang lebih besar dari 6 mm (Gambar Tambahan 10).
Gambar CT jendela aksial paru-paru dari dua kasus nodul jinak.Pada kasus 1, CT scan setelah 4 tahun menunjukkan nodul padat stabil berukuran 7 mm dengan kalsifikasi di lobus kanan bawah.Dalam kasus 2, CT scan setelah 5 tahun menunjukkan nodul stabil sebagian padat dengan diameter 7 mm di lobus kanan atas.b Gambar CT jendela aksial paru-paru dan studi patologis terkait dari dua kasus adenokarsinoma stadium I sebelum reseksi paru.Kasus 3 menunjukkan nodul dengan diameter 8 mm di lobus kanan atas dengan retraksi pleura.Kasus 4 menunjukkan nodul kaca tanah sebagian padat berukuran 9 mm di lobus kiri atas.Pewarnaan hematoxylin dan eosin (H&E) pada jaringan paru yang direseksi (skala bar = 50 μm) menunjukkan pola pertumbuhan asinar adenokarsinoma paru.Panah menunjukkan nodul terdeteksi pada gambar CT.Gambar H&E adalah gambar representatif dari beberapa (>3) bidang mikroskopis yang diperiksa oleh ahli patologi.
Secara keseluruhan, hasil kami menunjukkan nilai potensial biomarker metabolit serum dalam diagnosis banding nodul paru, yang mungkin menimbulkan tantangan ketika mengevaluasi skrining CT.
Berdasarkan panel metabolit diferensial yang divalidasi, kami berusaha mengidentifikasi korelasi biologis dari perubahan metabolisme utama.Analisis pengayaan jalur KEGG oleh MetaboAnalyst mengidentifikasi 6 jalur umum yang berubah secara signifikan antara dua kelompok yang diberikan (LA vs. HC dan LA vs. BN, penyesuaian p ≤ 0,001, efek > 0,01).Perubahan ini ditandai dengan gangguan metabolisme piruvat, metabolisme triptofan, metabolisme niasin dan nikotinamida, glikolisis, siklus TCA, dan metabolisme purin (Gambar 5a).Kami kemudian melakukan metabolisme yang ditargetkan untuk memverifikasi perubahan besar menggunakan kuantifikasi absolut.Penentuan metabolit umum pada jalur yang umum diubah dengan spektrometri massa triple quadrupole (QQQ) menggunakan standar metabolit otentik.Karakteristik demografi sampel target studi metabolomik dimasukkan dalam Tabel Tambahan 4. Konsisten dengan hasil metabolomik global kami, analisis kuantitatif mengkonfirmasi bahwa hipoksantin dan xantin, piruvat, dan laktat meningkat di LA dibandingkan dengan BN dan HC (Gambar 5b, c, p <0,05).Namun, tidak ada perbedaan signifikan dalam metabolit yang ditemukan antara BN dan HC.
Analisis pengayaan jalur KEGG terhadap metabolit yang berbeda secara signifikan pada kelompok LA dibandingkan dengan kelompok BN dan HC.Globaltest dua sisi digunakan, dan nilai p disesuaikan menggunakan metode Holm-Bonferroni (p disesuaikan ≤ 0,001 dan ukuran efek > 0,01).b–d Plot biola menunjukkan kadar hipoksantin, xantin, laktat, piruvat, dan triptofan dalam serum HC, BN, dan LA ditentukan dengan LC-MS/MS (n = 70 per kelompok).Garis putus-putus putih dan hitam masing-masing menunjukkan median dan kuartil.e Plot biola menunjukkan ekspresi mRNA Log2TPM (transkrip per juta) yang dinormalisasi dari SLC7A5 dan QPRT pada adenokarsinoma paru (n = 513) dibandingkan dengan jaringan paru normal (n = 59) dalam dataset LUAD-TCGA.Kotak putih mewakili rentang interkuartil, garis hitam horizontal di tengah mewakili median, dan garis hitam vertikal yang memanjang dari kotak mewakili interval kepercayaan (CI) 95%.f Plot korelasi Pearson ekspresi SLC7A5 dan GAPDH pada adenokarsinoma paru (n = 513) dan jaringan paru normal (n = 59) pada dataset TCGA.Area abu-abu mewakili 95% CI.r, koefisien korelasi Pearson.g Kadar triptofan seluler yang dinormalisasi dalam sel A549 ditransfeksi dengan kontrol shRNA nonspesifik (NC) dan shSLC7A5 (Sh1, Sh2) ditentukan oleh LC-MS/MS.Analisis statistik dari lima sampel yang independen secara biologis di setiap kelompok disajikan.h Kadar NADt seluler (NAD total, termasuk NAD+ dan NADH) dalam sel A549 (NC) dan sel A549 knockdown SLC7A5 (Sh1, Sh2).Analisis statistik dari tiga sampel yang independen secara biologis di setiap kelompok disajikan.i Aktivitas glikolitik sel A549 sebelum dan sesudah knockdown SLC7A5 diukur dengan laju pengasaman ekstraseluler (ECAR) (n = 4 sampel yang independen secara biologis per kelompok).2-DG,2-deoksi-D-glukosa.Uji t Student dua sisi digunakan dalam (b – h).Dalam (g – i), bilah kesalahan mewakili rata-rata ± SD, setiap percobaan dilakukan tiga kali secara independen dan hasilnya serupa.Sumber data disediakan dalam bentuk file data sumber.
Mempertimbangkan dampak signifikan dari perubahan metabolisme triptofan pada kelompok LA, kami juga menilai kadar triptofan serum pada kelompok HC, BN, dan LA menggunakan QQQ.Kami menemukan bahwa triptofan serum berkurang di LA dibandingkan dengan HC atau BN (p <0,001, Gambar 5d), yang konsisten dengan temuan sebelumnya bahwa kadar triptofan yang bersirkulasi lebih rendah pada pasien dengan kanker paru-paru dibandingkan pada kontrol sehat dari kelompok kontrol33,34 ,35.Studi lain yang menggunakan pelacak PET/CT 11C-metil-L-triptofan menemukan bahwa waktu retensi sinyal triptofan pada jaringan kanker paru meningkat secara signifikan dibandingkan dengan lesi jinak atau jaringan normal36.Kami berhipotesis bahwa penurunan triptofan dalam serum LA mungkin mencerminkan penyerapan triptofan aktif oleh sel kanker paru-paru.
Diketahui juga bahwa produk akhir jalur kynurenine dari katabolisme triptofan adalah NAD+37,38, yang merupakan substrat penting untuk reaksi gliseraldehida-3-fosfat dengan 1,3-bifosfogliserat dalam glikolisis39.Sementara penelitian sebelumnya berfokus pada peran katabolisme triptofan dalam regulasi kekebalan tubuh, kami berusaha menjelaskan interaksi antara disregulasi triptofan dan jalur glikolitik yang diamati dalam penelitian ini.Keluarga pengangkut zat terlarut 7 anggota 5 (SLC7A5) dikenal sebagai pengangkut triptofan43,44,45.Asam quinolinic fosforibosiltransferase (QPRT) adalah enzim yang terletak di hilir jalur kynurenine yang mengubah asam quinolinic menjadi NAMN46.Inspeksi dataset LUAD TCGA mengungkapkan bahwa SLC7A5 dan QPRT secara signifikan diregulasi dalam jaringan tumor dibandingkan dengan jaringan normal (Gambar 5e).Peningkatan ini diamati pada adenokarsinoma paru stadium I dan II serta stadium III dan IV (Gambar Tambahan 11), yang menunjukkan gangguan awal metabolisme triptofan yang terkait dengan tumorigenesis.
Selain itu, dataset LUAD-TCGA menunjukkan korelasi positif antara ekspresi mRNA SLC7A5 dan GAPDH dalam sampel pasien kanker (r = 0,45, p = 1,55E-26, Gambar 5f).Sebaliknya, tidak ada korelasi signifikan yang ditemukan antara tanda gen tersebut pada jaringan paru-paru normal (r = 0,25, p = 0,06, Gambar 5f).Knockdown SLC7A5 (Gambar Tambahan 12) dalam sel A549 secara signifikan mengurangi kadar triptofan seluler dan NAD(H) (Gambar 5g,h), menghasilkan aktivitas glikolitik yang dilemahkan yang diukur dengan laju pengasaman ekstraseluler (ECAR) (Gambar 1).5i).Jadi, berdasarkan perubahan metabolik dalam serum dan deteksi in vitro, kami berhipotesis bahwa metabolisme triptofan dapat menghasilkan NAD+ melalui jalur kynurenine dan memainkan peran penting dalam mendorong glikolisis pada kanker paru-paru.
Penelitian telah menunjukkan bahwa sejumlah besar nodul paru tak tentu yang terdeteksi oleh LDCT dapat menyebabkan perlunya pengujian tambahan seperti PET-CT, biopsi paru, dan pengobatan berlebihan karena diagnosis keganasan yang positif palsu.31 Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 6, penelitian kami mengidentifikasi panel metabolit serum dengan nilai diagnostik potensial yang dapat meningkatkan stratifikasi risiko dan pengelolaan selanjutnya dari nodul paru yang terdeteksi oleh CT.
Nodul paru dievaluasi menggunakan tomografi komputer dosis rendah (LDCT) dengan fitur pencitraan yang menunjukkan penyebab jinak atau ganas.Hasil yang tidak pasti dari nodul dapat menyebabkan seringnya kunjungan tindak lanjut, intervensi yang tidak perlu, dan pengobatan yang berlebihan.Dimasukkannya pengklasifikasi metabolik serum dengan nilai diagnostik dapat meningkatkan penilaian risiko dan penatalaksanaan nodul paru selanjutnya.Tomografi emisi positron PET.
Data dari studi NLST AS dan studi NELSON Eropa menunjukkan bahwa skrining kelompok risiko tinggi dengan tomografi komputer dosis rendah (LDCT) dapat mengurangi angka kematian akibat kanker paru-paru1,3.Namun, penilaian risiko dan penatalaksanaan klinis selanjutnya terhadap sejumlah besar nodul paru insidental yang terdeteksi oleh LDCT tetap menjadi tantangan yang paling besar.Tujuan utamanya adalah untuk mengoptimalkan klasifikasi yang benar dari protokol berbasis LDCT yang ada dengan menggabungkan biomarker yang andal.
Biomarker molekuler tertentu, seperti metabolit darah, telah diidentifikasi dengan membandingkan kanker paru-paru dengan kontrol yang sehat15,17.Dalam penelitian ini, kami fokus pada penerapan analisis metabolomik serum untuk membedakan antara nodul paru jinak dan ganas yang terdeteksi secara kebetulan oleh LDCT.Kami membandingkan sampel serum global kontrol sehat (HC), nodul paru jinak (BN), dan sampel adenokarsinoma paru (LA) stadium I menggunakan analisis UPLC-HRMS.Kami menemukan bahwa HC dan BN memiliki profil metabolisme yang serupa, sedangkan LA menunjukkan perubahan signifikan dibandingkan dengan HC dan BN.Kami mengidentifikasi dua set metabolit serum yang membedakan LA dari HC dan BN.
Skema identifikasi berbasis LDCT saat ini untuk nodul jinak dan ganas terutama didasarkan pada ukuran, kepadatan, morfologi dan laju pertumbuhan nodul dari waktu ke waktu30.Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa ukuran nodul berkaitan erat dengan kemungkinan terkena kanker paru-paru.Bahkan pada pasien berisiko tinggi, risiko keganasan pada kelenjar getah bening <6 mm adalah <1%.Risiko keganasan untuk nodul berukuran 6 hingga 20 mm berkisar antara 8% hingga 64%30.Oleh karena itu, Fleischner Society merekomendasikan diameter cutoff 6 mm untuk tindak lanjut CT rutin.29 Namun, penilaian risiko dan penatalaksanaan nodul paru tak tentu (IPN) yang lebih besar dari 6 mm belum dilakukan secara memadai31 .Penatalaksanaan penyakit jantung bawaan saat ini biasanya didasarkan pada penantian yang waspada dan pemantauan CT yang sering.
Berdasarkan metabolom yang divalidasi, untuk pertama kalinya kami menunjukkan tumpang tindih tanda metabolik antara individu sehat dan nodul jinak <6 mm.Kesamaan biologis ini konsisten dengan temuan CT sebelumnya yang menyatakan bahwa risiko keganasan pada nodul <6 mm sama rendahnya dengan subjek tanpa nodul.30 Perlu dicatat bahwa hasil kami juga menunjukkan bahwa nodul jinak <6 mm dan ≥6 mm memiliki tingkat keganasan yang tinggi. kesamaan dalam profil metabolik, menunjukkan bahwa definisi fungsional etiologi jinak konsisten terlepas dari ukuran nodul.Dengan demikian, panel metabolit serum diagnostik modern dapat memberikan pengujian tunggal sebagai tes yang tidak dapat dikesampingkan ketika nodul pertama kali terdeteksi pada CT dan berpotensi mengurangi pemantauan serial.Pada saat yang sama, panel biomarker metabolik yang sama membedakan nodul ganas berukuran ≥6 mm dari nodul jinak dan memberikan prediksi akurat untuk IPN dengan ukuran serupa dan gambaran morfologi ambigu pada gambar CT.Pengklasifikasi metabolisme serum ini bekerja dengan baik dalam memprediksi keganasan nodul ≥6 mm dengan AUC 0,927.Secara keseluruhan, hasil kami menunjukkan bahwa tanda metabolik serum yang unik mungkin secara spesifik mencerminkan perubahan metabolik awal yang disebabkan oleh tumor dan memiliki nilai potensial sebagai prediktor risiko, terlepas dari ukuran nodul.
Khususnya, adenokarsinoma paru (LUAD) dan karsinoma sel skuamosa (LUSC) adalah jenis utama kanker paru non-sel kecil (NSCLC).Mengingat bahwa LUSC sangat terkait dengan penggunaan tembakau47 dan LUAD adalah histologi paling umum dari nodul paru insidental yang terdeteksi pada pemeriksaan CT48, model pengklasifikasi kami secara khusus dibuat untuk sampel adenokarsinoma stadium I.Wang dan rekannya juga berfokus pada LUAD dan mengidentifikasi sembilan tanda lipid menggunakan lipidomik untuk membedakan kanker paru-paru stadium awal dari individu sehat17.Kami menguji model pengklasifikasi saat ini pada 16 kasus LUSC stadium I dan 74 nodul jinak dan mengamati akurasi prediksi LUSC yang rendah (AUC 0,776), menunjukkan bahwa LUAD dan LUSC mungkin memiliki ciri metaboliknya sendiri.Memang benar, LUAD dan LUSC telah terbukti berbeda dalam hal etiologi, asal biologis dan penyimpangan genetik49.Oleh karena itu, jenis histologi lain harus dimasukkan dalam model pelatihan deteksi kanker paru berbasis populasi dalam program skrining.
Di sini, kami mengidentifikasi enam jalur yang paling sering diubah pada adenokarsinoma paru dibandingkan dengan kontrol sehat dan nodul jinak.Xantin dan hipoksantin adalah metabolit umum dari jalur metabolisme purin.Konsisten dengan hasil kami, zat antara yang terkait dengan metabolisme purin meningkat secara signifikan dalam serum atau jaringan pasien dengan adenokarsinoma paru dibandingkan dengan kontrol sehat atau pasien pada tahap prainvasif15,50.Peningkatan kadar xantin dan hipoksantin serum mungkin mencerminkan anabolisme yang dibutuhkan oleh sel kanker yang berkembang biak dengan cepat.Disregulasi metabolisme glukosa merupakan ciri khas metabolisme kanker51.Di sini, kami mengamati peningkatan yang signifikan dalam piruvat dan laktat pada kelompok LA dibandingkan dengan kelompok HC dan BN, yang konsisten dengan laporan sebelumnya mengenai kelainan jalur glikolitik pada profil metabolisme serum pasien kanker paru-paru non-sel kecil (NSCLC) dan pasien kanker paru-paru non-sel kecil (NSCLC). kontrol yang sehat.hasilnya konsisten52,53.
Yang penting, kami mengamati korelasi terbalik antara metabolisme piruvat dan triptofan dalam serum adenokarsinoma paru.Kadar triptofan serum berkurang pada kelompok LA dibandingkan dengan kelompok HC atau BN.Menariknya, penelitian skala besar sebelumnya yang menggunakan kohort prospektif menemukan bahwa rendahnya tingkat triptofan yang beredar dikaitkan dengan peningkatan risiko kanker paru-paru54.Triptofan adalah asam amino esensial yang kita peroleh seluruhnya dari makanan.Kami menyimpulkan bahwa penipisan serum triptofan pada adenokarsinoma paru mungkin mencerminkan penipisan metabolit ini secara cepat.Telah diketahui bahwa produk akhir katabolisme triptofan melalui jalur kynurenine merupakan sumber sintesis NAD+ de novo.Karena NAD+ diproduksi terutama melalui jalur penyelamatan, pentingnya NAD+ dalam metabolisme triptofan dalam kesehatan dan penyakit masih harus ditentukan46.Analisis kami terhadap database TCGA menunjukkan bahwa ekspresi transporter triptofan zat terlarut transporter 7A5 (SLC7A5) meningkat secara signifikan pada adenokarsinoma paru dibandingkan dengan kontrol normal dan berkorelasi positif dengan ekspresi enzim glikolitik GAPDH.Penelitian sebelumnya terutama berfokus pada peran katabolisme triptofan dalam menekan respon imun antitumor40,41,42.Di sini kami menunjukkan bahwa penghambatan serapan triptofan dengan merobohkan SLC7A5 dalam sel kanker paru-paru menghasilkan penurunan kadar NAD seluler dan pelemahan aktivitas glikolitik secara bersamaan.Singkatnya, penelitian kami memberikan dasar biologis untuk perubahan metabolisme serum yang terkait dengan transformasi ganas adenokarsinoma paru.
Mutasi EGFR adalah mutasi pemicu yang paling umum pada pasien NSCLC.Dalam penelitian kami, kami menemukan bahwa pasien dengan mutasi EGFR (n = 41) memiliki profil metabolik keseluruhan yang mirip dengan pasien dengan EGFR tipe liar (n = 31), meskipun kami menemukan penurunan kadar serum beberapa pasien mutan EGFR pada pasien asilkarnitin.Fungsi asilkarnitin adalah untuk mengangkut gugus asil dari sitoplasma ke dalam matriks mitokondria, yang menyebabkan oksidasi asam lemak untuk menghasilkan energi 55 .Konsisten dengan temuan kami, sebuah penelitian baru-baru ini juga mengidentifikasi profil metabolom serupa antara tumor tipe liar EGFR mutan dan EGFR dengan menganalisis metabolisme global dari 102 sampel jaringan adenokarsinoma paru50.Menariknya, kandungan asilkarnitin juga ditemukan pada kelompok mutan EGFR.Oleh karena itu, apakah perubahan kadar asilkarnitin mencerminkan perubahan metabolisme yang diinduksi EGFR dan jalur molekuler yang mendasarinya mungkin memerlukan penelitian lebih lanjut.
Sebagai kesimpulan, penelitian kami menetapkan pengklasifikasi metabolik serum untuk diagnosis banding nodul paru dan mengusulkan alur kerja yang dapat mengoptimalkan penilaian risiko dan memfasilitasi manajemen klinis berdasarkan skrining CT scan.
Penelitian ini disetujui oleh Komite Etik Rumah Sakit Kanker Universitas Sun Yat-sen, Rumah Sakit Afiliasi Pertama Universitas Sun Yat-sen, dan Komite Etik Rumah Sakit Kanker Universitas Zhengzhou.Dalam kelompok penemuan dan validasi internal, 174 serum dari individu sehat dan 244 serum dari nodul jinak dikumpulkan dari individu yang menjalani pemeriksaan kesehatan tahunan di Departemen Pengendalian dan Pencegahan Kanker, Pusat Kanker Universitas Sun Yat-sen, dan 166 nodul jinak.serum.Adenokarsinoma paru stadium I dikumpulkan dari Pusat Kanker Universitas Sun Yat-sen.Pada kohort validasi eksternal, terdapat 48 kasus nodul jinak, 39 kasus adenokarsinoma paru stadium I dari Rumah Sakit Afiliasi Pertama Universitas Sun Yat-sen, dan 24 kasus adenokarsinoma paru stadium I dari Rumah Sakit Kanker Zhengzhou.Pusat Kanker Universitas Sun Yat-sen juga mengumpulkan 16 kasus kanker paru-paru sel skuamosa stadium I untuk menguji kemampuan diagnostik pengklasifikasi metabolik yang sudah ada (karakteristik pasien ditunjukkan pada Tabel Tambahan 5).Sampel dari kelompok penemuan dan kelompok validasi internal dikumpulkan antara bulan Januari 2018 dan Mei 2020. Sampel untuk kelompok validasi eksternal dikumpulkan antara bulan Agustus 2021 dan Oktober 2022. Untuk meminimalkan bias gender, jumlah kasus laki-laki dan perempuan yang ditempatkan pada masing-masing kelompok berjumlah kira-kira sama. kelompok.Tim Penemuan dan Tim Peninjau Internal.Jenis kelamin peserta ditentukan berdasarkan laporan diri.Persetujuan diperoleh dari semua peserta dan tidak ada kompensasi yang diberikan.Subjek dengan nodul jinak adalah mereka yang memiliki skor CT scan yang stabil pada 2 hingga 5 tahun pada saat analisis, kecuali 1 kasus dari sampel validasi eksternal, yang dikumpulkan sebelum operasi dan didiagnosis berdasarkan histopatologi.Kecuali bronkitis kronis.Kasus adenokarsinoma paru dikumpulkan sebelum reseksi paru dan dikonfirmasi dengan diagnosis patologis.Sampel darah puasa dikumpulkan dalam tabung pemisah serum tanpa antikoagulan apa pun.Sampel darah dibekukan selama 1 jam pada suhu kamar dan kemudian disentrifugasi pada 2851 × g selama 10 menit pada suhu 4°C untuk mengumpulkan supernatan serum.Aliquot serum dibekukan pada suhu -80 ° C sampai ekstraksi metabolit.Departemen Pencegahan Kanker dan Pemeriksaan Medis dari Pusat Kanker Universitas Sun Yat-sen mengumpulkan serum dari 100 donor sehat, termasuk pria dan wanita berusia 40 hingga 55 tahun dalam jumlah yang sama.Setiap sampel donor dicampur dengan volume yang sama, kumpulan yang dihasilkan dikumpulkan dan disimpan pada suhu -80°C.Campuran serum digunakan sebagai bahan referensi untuk pengendalian kualitas dan standarisasi data.
Serum referensi dan sampel uji dicairkan dan metabolitnya diekstraksi menggunakan metode ekstraksi gabungan (MTBE/metanol/air) 56 .Secara singkat, 50 μl serum dicampur dengan 225 μl metanol dingin dan 750 μl metil tert-butil eter (MTBE) dingin.Aduk campuran dan inkubasi dalam es selama 1 jam.Sampel kemudian dicampur dan divorteks dicampur dengan 188 μl air tingkat MS yang mengandung standar internal (13C-laktat, 13C3-piruvat, 13C-metionin, dan 13C6-isoleusin, dibeli dari Laboratorium Isotop Cambridge).Campuran kemudian disentrifugasi pada 15.000 × g selama 10 menit pada suhu 4 ° C, dan fase bawah dipindahkan ke dalam dua tabung (masing-masing 125 μL) untuk analisis LC-MS dalam mode positif dan negatif.Terakhir, sampel diuapkan hingga kering dalam konsentrator vakum berkecepatan tinggi.
Metabolit kering dilarutkan dalam 120 μl asetonitril 80%, divorteks selama 5 menit, dan disentrifugasi pada 15.000 × g selama 10 menit pada suhu 4°C.Supernatan dipindahkan ke dalam botol kaca kuning dengan sisipan mikro untuk studi metabolomik.Analisis metabolomik yang tidak ditargetkan pada platform kromatografi cair kinerja ultra-spektrometri massa resolusi tinggi (UPLC-HRMS).Metabolit dipisahkan menggunakan sistem Dionex Ultimate 3000 UPLC dan kolom ACQUITY BEH Amide (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters).Dalam mode ion positif, fase geraknya adalah 95% (A) dan 50% asetonitril (B), masing-masing mengandung 10 mmol/L amonium asetat dan 0,1% asam format.Dalam mode negatif, fase gerak A dan B masing-masing mengandung 95% dan 50% asetonitril, kedua fase tersebut mengandung 10 mmol/L amonium asetat, pH = 9. Program gradiennya adalah sebagai berikut: 0–0,5 menit, 2% B;0,5–12 menit, 2–50% B;12–14 menit, 50–98% B;14–16 menit, 98% B;16–16.1.min, 98 –2%B;16,1–20 menit, 2% B. Kolom dipertahankan pada suhu 40°C dan sampel pada suhu 10°C dalam autosampler.Laju aliran 0,3 ml/menit, volume injeksi 3 μl.Spektrometer massa Q-Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) dengan sumber ionisasi elektrospray (ESI) dioperasikan dalam mode pemindaian penuh dan digabungkan dengan mode pemantauan ddMS2 untuk mengumpulkan data dalam jumlah besar.Parameter MS diatur sebagai berikut: tegangan semprotan +3,8 kV/- 3,2 kV, suhu kapiler 320°C, gas pelindung 40 arb, gas tambahan 10 arb, suhu pemanas probe 350°C, rentang pemindaian 70–1050 m3/ jam, resolusi.70.000. Data diperoleh dengan menggunakan Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Untuk menilai kualitas data, sampel pooled quality control (QC) dihasilkan dengan menghilangkan 10 μL alikuot supernatan dari setiap sampel.Enam injeksi sampel kontrol kualitas dianalisis pada awal urutan analitis untuk menilai stabilitas sistem UPLC-MS.Sampel kendali mutu kemudian secara berkala dimasukkan ke dalam batch.Seluruh 11 batch sampel serum dalam penelitian ini dianalisis dengan LC-MS.Aliquot campuran kumpulan serum dari 100 donor sehat digunakan sebagai bahan referensi di masing-masing batch untuk memantau proses ekstraksi dan menyesuaikan efek batch-to-batch.Analisis metabolomik yang tidak ditargetkan pada kelompok penemuan, kelompok validasi internal, dan kelompok validasi eksternal dilakukan di Pusat Metabolomik Universitas Sun Yat-sen.Laboratorium eksternal Pusat Analisis dan Pengujian Universitas Teknologi Guangdong juga menganalisis 40 sampel dari kelompok eksternal untuk menguji kinerja model pengklasifikasi.
Setelah ekstraksi dan rekonstitusi, kuantisasi absolut metabolit serum diukur menggunakan spektrometri massa tandem kromatografi cair kinerja sangat tinggi (Agilent 6495 triple quadrupole) dengan sumber ionisasi elektrospray (ESI) dalam mode pemantauan reaksi ganda (MRM).Kolom ACQUITY BEH Amide (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters) digunakan untuk memisahkan metabolit.Fase gerak terdiri dari 90% (A) dan 5% asetonitril (B) dengan 10 mmol/L amonium asetat dan larutan amonia 0,1%.Program gradiennya adalah sebagai berikut: 0–1,5 menit, 0% B;1,5–6,5 menit, 0–15% B;6,5–8 menit, 15% B;8–8,5 menit, 15%–0%B;8,5–11,5 mnt, 0%B.Kolom dipertahankan pada suhu 40 °C dan sampel pada suhu 10 °C dalam autosampler.Laju aliran adalah 0,3 mL/menit dan volume injeksi adalah 1 μL.Parameter MS ditetapkan sebagai berikut: tegangan kapiler ±3,5 kV, tekanan nebulizer 35 psi, aliran gas selubung 12 L/menit, suhu gas selubung 350°C, suhu gas pengering 250°C, dan aliran gas pengering 14 l/menit.Konversi MRM triptofan, piruvat, laktat, hipoksantin, dan xantin adalah 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3, dan 151,0–107.9 masing-masing.Data dikumpulkan menggunakan Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies).Untuk sampel serum, triptofan, piruvat, laktat, hipoksantin, dan xantin diukur menggunakan kurva kalibrasi larutan campuran standar.Untuk sampel sel, kandungan triptofan dinormalisasi dengan standar internal dan massa protein sel.
Ekstraksi puncak (m/z dan waktu retensi (RT)) dilakukan menggunakan Compound Discovery 3.1 dan TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific).Untuk menghilangkan perbedaan potensial antar batch, setiap puncak karakteristik sampel uji dibagi dengan puncak karakteristik bahan referensi dari batch yang sama untuk mendapatkan kelimpahan relatif.Deviasi standar relatif dari standar internal sebelum dan sesudah standardisasi ditunjukkan pada Tabel Tambahan 6. Perbedaan antara kedua kelompok ditandai oleh tingkat penemuan palsu (FDR<0,05, uji peringkat bertanda Wilcoxon) dan perubahan lipat (>1,2 atau <0,83).Data MS mentah dari fitur yang diekstraksi dan data referensi MS yang dikoreksi serum masing-masing ditunjukkan dalam Data Tambahan 1 dan Data Tambahan 2.Anotasi puncak dilakukan berdasarkan empat tingkat identifikasi yang ditentukan, termasuk metabolit yang teridentifikasi, senyawa yang diberi anotasi diduga, kelas senyawa yang diduga berciri, dan senyawa yang tidak diketahui 22 .Berdasarkan pencarian database di Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider), senyawa biologis dengan standar tervalidasi pencocokan MS/MS atau anotasi pencocokan tepat di mzCloud (skor > 85) atau Chemspider akhirnya dipilih sebagai perantara antara metabolisme diferensial.Anotasi puncak untuk setiap fitur disertakan dalam Data Tambahan 3. MetaboAnalyst 5.0 digunakan untuk analisis univariat jumlah kelimpahan metabolit yang dinormalisasi.MetaboAnalyst 5.0 juga mengevaluasi analisis pengayaan jalur KEGG berdasarkan metabolit yang berbeda secara signifikan.Analisis komponen utama (PCA) dan analisis diskriminan kuadrat terkecil parsial (PLS-DA) dianalisis menggunakan paket perangkat lunak ropls (v.1.26.4) dengan normalisasi tumpukan dan penskalaan otomatis.Model biomarker metabolit optimal untuk memprediksi keganasan nodul dihasilkan menggunakan regresi logistik biner dengan operator penyusutan dan seleksi absolut paling sedikit (LASSO, paket R v.4.1-3).Kinerja model diskriminan dalam set deteksi dan validasi ditandai dengan memperkirakan AUC berdasarkan analisis ROC sesuai dengan paket pROC (v.1.18.0.).Batas probabilitas optimal diperoleh berdasarkan indeks Youden maksimum model (sensitivitas + spesifisitas – 1).Sampel dengan nilai yang lebih kecil atau lebih besar dari ambang batas masing-masing akan diprediksi sebagai nodul jinak dan adenokarsinoma paru.
Sel A549 (#CCL-185, American Type Culture Collection) ditanam dalam media F-12K yang mengandung 10% FBS.Urutan RNA jepit rambut pendek (shRNA) yang menargetkan SLC7A5 dan kontrol nontargeting (NC) dimasukkan ke dalam vektor lentiviral pLKO.1-puro.Urutan antisense shSLC7A5 adalah sebagai berikut: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′).Antibodi terhadap SLC7A5 (#5347) dan tubulin (#2148) dibeli dari Cell Signaling Technology.Antibodi terhadap SLC7A5 dan tubulin digunakan pada pengenceran 1:1000 untuk analisis Western blot.
Tes Stres Glikolitik Seahorse XF mengukur tingkat pengasaman ekstraseluler (ECAR).Dalam pengujian tersebut, glukosa, oligomisin A, dan 2-DG diberikan secara berurutan untuk menguji kapasitas glikolitik seluler yang diukur dengan ECAR.
Sel A549 yang ditransfeksi dengan kontrol non-penargetan (NC) dan shSLC7A5 (Sh1, Sh2) disepuh semalaman dalam piringan berdiameter 10 cm.Metabolit sel diekstraksi dengan 1 ml metanol berair 80% dingin.Sel-sel dalam larutan metanol dikikis, dikumpulkan ke dalam tabung baru, dan disentrifugasi pada 15.000 × g selama 15 menit pada suhu 4°C.Kumpulkan 800 μl supernatan dan keringkan menggunakan konsentrator vakum berkecepatan tinggi.Pelet metabolit kering kemudian dianalisis kadar triptofan menggunakan LC-MS/MS seperti dijelaskan di atas.Kadar NAD(H) seluler dalam sel A549 (NC dan shSLC7A5) diukur menggunakan kit kolorimetri NAD+/NADH kuantitatif (#K337, BioVision) sesuai dengan instruksi pabrik.Kadar protein diukur untuk setiap sampel untuk menormalkan jumlah metabolit.
Tidak ada metode statistik yang digunakan untuk menentukan ukuran sampel terlebih dahulu.Studi metabolomik sebelumnya yang ditujukan untuk penemuan biomarker15,18 telah dianggap sebagai tolok ukur penentuan ukuran, dan dibandingkan dengan laporan-laporan ini, sampel kami sudah memadai.Tidak ada sampel yang dikeluarkan dari kelompok penelitian.Sampel serum secara acak dimasukkan ke dalam kelompok penemuan (306 kasus, 74,6%) dan kelompok validasi internal (104 kasus, 25,4%) untuk studi metabolomik yang tidak ditargetkan.Kami juga secara acak memilih 70 kasus dari masing-masing kelompok dari kumpulan penemuan untuk studi metabolomik yang ditargetkan.Para peneliti tidak mengetahui tugas kelompok selama pengumpulan dan analisis data LC-MS.Analisis statistik data metabolomik dan eksperimen sel dijelaskan di bagian Hasil, Gambar Legenda, dan Metode.Kuantifikasi aktivitas triptofan seluler, NADT, dan glikolitik dilakukan tiga kali secara independen dengan hasil yang identik.
Untuk informasi lebih lanjut tentang desain penelitian, lihat Abstrak Laporan Portofolio Alami yang terkait dengan artikel ini.
Data MS mentah dari fitur yang diekstraksi dan data MS yang dinormalisasi dari serum referensi masing-masing ditunjukkan dalam Data Tambahan 1 dan Data Tambahan 2.Anotasi puncak untuk fitur diferensial disajikan dalam Data Tambahan 3. Kumpulan data LUAD TCGA dapat diunduh dari https://portal.gdc.cancer.gov/.Data masukan untuk membuat grafik disediakan dalam data sumber.Sumber data disediakan untuk artikel ini.
Kelompok Studi Skrining Paru-Paru Nasional, dll. Mengurangi angka kematian akibat kanker paru-paru dengan tomografi komputer dosis rendah.Inggris Utara.J.Med.365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR dan Prophet, PC Skrining kanker paru-paru menggunakan CT heliks dosis rendah: hasil dari National Lung Screening Study (NLST).J.Med.Layar 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ, dkk.Mengurangi angka kematian akibat kanker paru-paru dengan skrining CT volumetrik dalam uji coba secara acak.Inggris Utara.J.Med.382, 503–513 (2020).
Waktu posting: 18 Sep-2023