Diagnosis diferensial nodul paru yang diidentifikasi dengan computed tomography (CT) masih menjadi tantangan dalam praktik klinis. Di sini, kami mengkarakterisasi metabolom global dari 480 sampel serum, termasuk kontrol sehat, nodul paru jinak, dan adenokarsinoma paru stadium I. Adenokarsinoma menunjukkan profil metabolomik yang unik, sedangkan nodul jinak dan individu sehat memiliki kemiripan yang tinggi dalam profil metabolomik. Dalam kelompok penemuan (n = 306), serangkaian 27 metabolit diidentifikasi untuk membedakan antara nodul jinak dan ganas. AUC dari model diskriminan dalam kelompok validasi internal (n = 104) dan validasi eksternal (n = 111) masing-masing adalah 0,915 dan 0,945. Analisis jalur mengungkapkan peningkatan metabolit glikolitik yang terkait dengan penurunan triptofan dalam serum adenokarsinoma paru dibandingkan dengan nodul jinak dan kontrol sehat, dan menunjukkan bahwa penyerapan triptofan mendorong glikolisis dalam sel kanker paru. Studi kami menyoroti nilai biomarker metabolit serum dalam menilai risiko nodul paru yang terdeteksi melalui CT.
Diagnosis dini sangat penting untuk meningkatkan angka harapan hidup pasien kanker. Hasil dari Uji Coba Skrining Kanker Paru Nasional AS (NLST) dan Studi NELSON Eropa telah menunjukkan bahwa skrining dengan tomografi komputer dosis rendah (LDCT) dapat secara signifikan mengurangi angka kematian akibat kanker paru pada kelompok berisiko tinggi1,2,3. Sejak penggunaan LDCT yang meluas untuk skrining kanker paru, insiden temuan radiografi insidental nodul paru asimptomatik terus meningkat 4. Nodul paru didefinisikan sebagai opasitas fokal hingga berdiameter 3 cm 5. Kita menghadapi kesulitan dalam menilai kemungkinan keganasan dan menangani sejumlah besar nodul paru yang terdeteksi secara insidental pada LDCT. Keterbatasan CT dapat menyebabkan pemeriksaan tindak lanjut yang sering dan hasil positif palsu, yang menyebabkan intervensi yang tidak perlu dan pengobatan berlebihan6. Oleh karena itu, ada kebutuhan untuk mengembangkan biomarker yang andal dan bermanfaat untuk mengidentifikasi kanker paru secara tepat pada tahap awal dan membedakan sebagian besar nodul jinak pada deteksi awal 7.
Analisis molekuler komprehensif darah (serum, plasma, sel mononuklear darah tepi), termasuk genomik, proteomik, atau metilasi DNA8,9,10, telah menyebabkan meningkatnya minat dalam penemuan biomarker diagnostik untuk kanker paru-paru. Sementara itu, pendekatan metabolomik mengukur produk akhir seluler yang dipengaruhi oleh aksi endogen dan eksogen dan oleh karena itu diterapkan untuk memprediksi timbulnya penyakit dan hasilnya. Kromatografi cair-spektrometri massa tandem (LC-MS) adalah metode yang banyak digunakan untuk studi metabolomik karena sensitivitasnya yang tinggi dan rentang dinamis yang besar, yang dapat mencakup metabolit dengan sifat fisikokimia yang berbeda11,12,13. Meskipun analisis metabolomik global plasma/serum telah digunakan untuk mengidentifikasi biomarker yang terkait dengan diagnosis kanker paru-paru14,15,16,17 dan efektivitas pengobatan,18 pengklasifikasi metabolit serum untuk membedakan antara nodul paru-paru jinak dan ganas masih perlu banyak diteliti.
Adenokarsinoma dan karsinoma sel skuamosa adalah dua subtipe utama kanker paru-paru non-sel kecil (NSCLC). Berbagai tes skrining CT menunjukkan bahwa adenokarsinoma adalah tipe histologis kanker paru-paru yang paling umum1,19,20,21. Dalam penelitian ini, kami menggunakan kromatografi cair kinerja ultra-tinggi-spektrometri massa resolusi tinggi (UPLC-HRMS) untuk melakukan analisis metabolomik pada total 695 sampel serum, termasuk kontrol sehat, nodul paru jinak, dan adenokarsinoma paru stadium I yang terdeteksi CT dengan ukuran ≤3 cm. Kami mengidentifikasi panel metabolit serum yang membedakan adenokarsinoma paru dari nodul jinak dan kontrol sehat. Analisis pengayaan jalur mengungkapkan bahwa metabolisme triptofan dan glukosa yang abnormal merupakan perubahan umum pada adenokarsinoma paru dibandingkan dengan nodul jinak dan kontrol sehat. Akhirnya, kami menetapkan dan memvalidasi pengklasifikasi metabolik serum dengan spesifisitas dan sensitivitas tinggi untuk membedakan antara nodul paru ganas dan jinak yang terdeteksi oleh LDCT, yang dapat membantu dalam diagnosis diferensial dini dan penilaian risiko.
Dalam penelitian ini, sampel serum yang disesuaikan berdasarkan jenis kelamin dan usia dikumpulkan secara retrospektif dari 174 kontrol sehat, 292 pasien dengan nodul paru jinak, dan 229 pasien dengan adenokarsinoma paru stadium I. Karakteristik demografis dari 695 subjek ditunjukkan pada Tabel Tambahan 1.
Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1a, total 480 sampel serum, termasuk 174 kontrol sehat (HC), 170 nodul jinak (BN), dan 136 adenokarsinoma paru stadium I (LA), dikumpulkan di Pusat Kanker Universitas Sun Yat-sen. Kohort penemuan untuk profil metabolomik tanpa target menggunakan kromatografi cair kinerja ultra-tinggi-spektrometri massa resolusi tinggi (UPLC-HRMS). Seperti yang ditunjukkan pada Gambar Tambahan 1, metabolit diferensial antara LA dan HC, LA dan BN diidentifikasi untuk membangun model klasifikasi dan selanjutnya mengeksplorasi analisis jalur diferensial. 104 sampel yang dikumpulkan oleh Pusat Kanker Universitas Sun Yat-sen dan 111 sampel yang dikumpulkan oleh dua rumah sakit lain masing-masing menjalani validasi internal dan eksternal.
a Populasi studi dalam kohort penemuan yang menjalani analisis metabolomik serum global menggunakan kromatografi cair kinerja ultra-tinggi-spektrometri massa resolusi tinggi (UPLC-HRMS). b Analisis diskriminan kuadrat terkecil parsial (PLS-DA) dari total metabolom 480 sampel serum dari kohort studi, termasuk kontrol sehat (HC, n = 174), nodul jinak (BN, n = 170), dan adenokarsinoma paru stadium I (Los Angeles, n = 136). +ESI, mode ionisasi elektrospray positif, -ESI, mode ionisasi elektrospray negatif. c–e Metabolit dengan kelimpahan yang berbeda secara signifikan dalam dua kelompok tertentu (uji peringkat bertanda Wilcoxon dua arah, nilai p yang disesuaikan dengan tingkat penemuan palsu, FDR <0,05) ditunjukkan dengan warna merah (perubahan lipat > 1,2) dan biru (perubahan lipat < 0,83). ) ditunjukkan pada grafik gunung berapi. f Peta panas pengelompokan hierarkis yang menunjukkan perbedaan signifikan dalam jumlah metabolit yang dianotasi antara LA dan BN. Data sumber disediakan dalam bentuk berkas data sumber.
Metabolom serum total dari 174 HC, 170 BN, dan 136 LA dalam kelompok penemuan dianalisis menggunakan analisis UPLC-HRMS. Pertama, kami menunjukkan bahwa sampel kontrol kualitas (QC) mengelompok rapat di tengah model analisis komponen utama (PCA) tanpa pengawasan, yang mengkonfirmasi stabilitas kinerja penelitian saat ini (Gambar Tambahan 2).
Seperti yang ditunjukkan dalam analisis diskriminan kuadrat terkecil parsial (PLS-DA) pada Gambar 1b, kami menemukan bahwa terdapat perbedaan yang jelas antara LA dan BN, LA dan HC dalam mode ionisasi elektrospray positif (+ESI) dan negatif (−ESI). Namun, tidak ditemukan perbedaan signifikan antara BN dan HC dalam kondisi +ESI dan -ESI.
Kami menemukan 382 fitur diferensial antara LA dan HC, 231 fitur diferensial antara LA dan BN, dan 95 fitur diferensial antara BN dan HC (uji peringkat bertanda Wilcoxon, FDR <0,05 dan perubahan ganda >1,2 atau <0,83) (Gambar 1c-e). Puncak-puncak tersebut selanjutnya dianotasi (Data Tambahan 3) terhadap basis data (perpustakaan mzCloud/HMDB/Chemspider) berdasarkan nilai m/z, waktu retensi, dan pencarian spektrum massa fragmentasi (rincian dijelaskan di bagian Metode) 22. Akhirnya, 33 dan 38 metabolit yang dianotasi dengan perbedaan kelimpahan yang signifikan diidentifikasi untuk LA versus BN (Gambar 1f dan Tabel Tambahan 2) dan LA versus HC (Gambar Tambahan 3 dan Tabel Tambahan 2), masing-masing. Sebaliknya, hanya 3 metabolit dengan perbedaan kelimpahan yang signifikan yang diidentifikasi pada BN dan HC (Tabel Tambahan 2), konsisten dengan tumpang tindih antara BN dan HC dalam PLS-DA. Metabolit diferensial ini mencakup berbagai macam senyawa biokimia (Gambar Tambahan 4). Secara keseluruhan, hasil ini menunjukkan perubahan signifikan pada metabolom serum yang mencerminkan transformasi ganas kanker paru stadium awal dibandingkan dengan nodul paru jinak atau subjek sehat. Sementara itu, kesamaan metabolom serum BN dan HC menunjukkan bahwa nodul paru jinak mungkin memiliki banyak karakteristik biologis yang sama dengan individu sehat. Mengingat mutasi gen reseptor faktor pertumbuhan epidermal (EGFR) umum terjadi pada subtipe adenokarsinoma paru 23, kami berupaya menentukan dampak mutasi pendorong pada metabolom serum. Kemudian kami menganalisis profil metabolomik keseluruhan dari 72 kasus dengan status EGFR dalam kelompok adenokarsinoma paru. Menariknya, kami menemukan profil yang sebanding antara pasien mutan EGFR (n = 41) dan pasien EGFR tipe liar (n = 31) dalam analisis PCA (Gambar Tambahan 5a). Namun, kami mengidentifikasi 7 metabolit yang kelimpahannya berubah secara signifikan pada pasien dengan mutasi EGFR dibandingkan dengan pasien dengan EGFR tipe liar (uji t, p < 0,05 dan perubahan lipatan > 1,2 atau < 0,83) (Gambar Tambahan 5b). Mayoritas metabolit ini (5 dari 7) adalah asilkarinitin, yang memainkan peran penting dalam jalur oksidasi asam lemak.
Seperti yang diilustrasikan dalam alur kerja yang ditunjukkan pada Gambar 2a, biomarker untuk klasifikasi nodul diperoleh menggunakan operator penyusutan absolut terkecil dan seleksi berdasarkan 33 metabolit diferensial yang diidentifikasi di LA (n = 136) dan BN (n = 170). Kombinasi variabel terbaik (LASSO) – model regresi logistik biner. Validasi silang sepuluh kali lipat digunakan untuk menguji keandalan model. Seleksi variabel dan regularisasi parameter disesuaikan dengan penalti maksimisasi kemungkinan dengan parameter λ24. Analisis metabolomik global selanjutnya dilakukan secara independen dalam kelompok validasi internal (n = 104) dan validasi eksternal (n = 111) untuk menguji kinerja klasifikasi model diskriminan. Hasilnya, 27 metabolit dalam set penemuan diidentifikasi sebagai model diskriminan terbaik dengan nilai AUC rata-rata terbesar (Gambar 2b), di antaranya 9 memiliki peningkatan aktivitas dan 18 penurunan aktivitas di LA dibandingkan dengan BN (Gambar 2c).
Alur kerja untuk membangun pengklasifikasi nodul paru, termasuk memilih panel metabolit serum terbaik dalam set penemuan menggunakan model regresi logistik biner melalui validasi silang sepuluh kali lipat dan mengevaluasi kinerja prediktif dalam set validasi internal dan eksternal. b Statistik validasi silang model regresi LASSO untuk pemilihan biomarker metabolik. Angka-angka yang diberikan di atas mewakili jumlah rata-rata biomarker yang dipilih pada λ tertentu. Garis putus-putus merah mewakili nilai AUC rata-rata pada lambda yang sesuai. Batang kesalahan abu-abu mewakili nilai AUC minimum dan maksimum. Garis putus-putus menunjukkan model terbaik dengan 27 biomarker yang dipilih. AUC, area di bawah kurva karakteristik operasi penerima (ROC). c Perubahan lipat dari 27 metabolit yang dipilih dalam kelompok LA dibandingkan dengan kelompok BN dalam kelompok penemuan. Kolom merah – aktivasi. Kolom biru adalah penurunan. d–f Kurva karakteristik operasi penerima (ROC) yang menunjukkan kekuatan model diskriminan berdasarkan 27 kombinasi metabolit dalam set penemuan, validasi internal, dan validasi eksternal. Data sumber disediakan dalam bentuk berkas data sumber.
Model prediksi dibuat berdasarkan koefisien regresi tertimbang dari 27 metabolit ini (Tabel Tambahan 3). Analisis ROC berdasarkan 27 metabolit ini menghasilkan nilai area di bawah kurva (AUC) sebesar 0,933, sensitivitas kelompok penemuan sebesar 0,868, dan spesifisitas sebesar 0,859 (Gambar 2d). Sementara itu, di antara 38 metabolit diferensial yang dianotasi antara LA dan HC, satu set 16 metabolit mencapai AUC sebesar 0,902 dengan sensitivitas 0,801 dan spesifisitas 0,856 dalam membedakan LA dari HC (Gambar Tambahan 6a-c). Nilai AUC berdasarkan ambang batas perubahan lipatan yang berbeda untuk metabolit diferensial juga dibandingkan. Kami menemukan bahwa model klasifikasi berkinerja terbaik dalam membedakan antara LA dan BN (HC) ketika tingkat perubahan lipatan ditetapkan pada 1,2 dibandingkan dengan 1,5 atau 2,0 (Gambar Tambahan 7a,b). Model klasifikasi, berdasarkan 27 kelompok metabolit, selanjutnya divalidasi dalam kohort internal dan eksternal. AUC adalah 0,915 (sensitivitas 0,867, spesifisitas 0,811) untuk validasi internal dan 0,945 (sensitivitas 0,810, spesifisitas 0,979) untuk validasi eksternal (Gambar 2e, f). Untuk menilai efisiensi antar laboratorium, 40 sampel dari kohort eksternal dianalisis di laboratorium eksternal seperti yang dijelaskan dalam bagian Metode. Akurasi klasifikasi mencapai AUC sebesar 0,925 (Gambar Tambahan 8). Karena karsinoma sel skuamosa paru (LUSC) adalah subtipe kanker paru non-sel kecil (NSCLC) kedua yang paling umum setelah adenokarsinoma paru (LUAD), kami juga menguji potensi kegunaan profil metabolik yang telah divalidasi. BN dan 16 kasus LUSC. AUC diskriminasi antara LUSC dan BN adalah 0,776 (Gambar Tambahan 9), yang menunjukkan kemampuan yang lebih buruk dibandingkan dengan diskriminasi antara LUAD dan BN.
Studi menunjukkan bahwa ukuran nodul pada citra CT berkorelasi positif dengan kemungkinan keganasan dan tetap menjadi penentu utama pengobatan nodul25,26,27. Analisis data dari kohort besar studi skrining NELSON menunjukkan bahwa risiko keganasan pada subjek dengan nodul <5 mm bahkan serupa dengan risiko pada subjek tanpa nodul28. Oleh karena itu, ukuran minimum yang memerlukan pemantauan CT secara teratur adalah 5 mm, seperti yang direkomendasikan oleh British Thoracic Society (BTS), dan 6 mm, seperti yang direkomendasikan oleh Fleischner Society29. Namun, nodul yang lebih besar dari 6 mm dan tanpa ciri jinak yang jelas, yang disebut nodul paru indeterminate (IPN), tetap menjadi tantangan utama dalam evaluasi dan manajemen dalam praktik klinis30,31. Selanjutnya, kami memeriksa apakah ukuran nodul memengaruhi tanda metabolomik menggunakan sampel gabungan dari kohort penemuan dan validasi internal. Dengan berfokus pada 27 biomarker yang telah divalidasi, kami pertama-tama membandingkan profil PCA dari metabolom HC dan BN sub-6 mm. Kami menemukan bahwa sebagian besar titik data untuk HC dan BN tumpang tindih, menunjukkan bahwa kadar metabolit serum serupa di kedua kelompok (Gambar 3a). Peta fitur di berbagai rentang ukuran tetap terjaga pada BN dan LA (Gambar 3b, c), sedangkan pemisahan diamati antara nodul ganas dan jinak dalam rentang 6–20 mm (Gambar 3d). Kohort ini memiliki AUC sebesar 0,927, spesifisitas 0,868, dan sensitivitas 0,820 untuk memprediksi keganasan nodul berukuran 6 hingga 20 mm (Gambar 3e, f). Hasil kami menunjukkan bahwa pengklasifikasi dapat menangkap perubahan metabolisme yang disebabkan oleh transformasi ganas dini, terlepas dari ukuran nodul.
ad Perbandingan profil PCA antara kelompok tertentu berdasarkan pengklasifikasi metabolik dari 27 metabolit. CC dan BN < 6 mm. b BN < 6 mm vs BN 6–20 mm. pada LA 6–20 mm versus LA 20–30 mm. g BN 6–20 mm dan LA 6–20 mm. GC, n = 174; BN < 6 mm, n = 153; BN 6–20 mm, n = 91; LA 6–20 mm, n = 89; LA 20–30 mm, n = 77. e Kurva karakteristik operasi penerima (ROC) yang menunjukkan kinerja model diskriminan untuk nodul 6–20 mm. f Nilai probabilitas dihitung berdasarkan model regresi logistik untuk nodul berukuran 6–20 mm. Garis putus-putus abu-abu mewakili nilai batas optimal (0,455). Angka-angka di atas mewakili persentase kasus yang diproyeksikan untuk Los Angeles. Gunakan uji t Student dua arah. PCA, analisis komponen utama. AUC, area di bawah kurva. Data sumber disediakan dalam bentuk file data sumber.
Empat sampel (berusia 44–61 tahun) dengan ukuran nodul paru yang serupa (7–9 mm) dipilih lebih lanjut untuk mengilustrasikan kinerja model prediksi keganasan yang diusulkan (Gambar 4a, b). Pada skrining awal, Kasus 1 tampak sebagai nodul padat dengan kalsifikasi, suatu ciri yang terkait dengan jinak, sedangkan Kasus 2 tampak sebagai nodul sebagian padat yang tidak pasti tanpa ciri jinak yang jelas. Tiga putaran pemindaian CT tindak lanjut menunjukkan bahwa kasus-kasus ini tetap stabil selama periode 4 tahun dan oleh karena itu dianggap sebagai nodul jinak (Gambar 4a). Dibandingkan dengan evaluasi klinis pemindaian CT serial, analisis metabolit serum sekali tembak dengan model pengklasifikasi saat ini dengan cepat dan tepat mengidentifikasi nodul jinak ini berdasarkan batasan probabilitas (Tabel 1). Gambar 4b pada kasus 3 menunjukkan nodul dengan tanda-tanda retraksi pleura, yang paling sering dikaitkan dengan keganasan32. Kasus 4 tampak sebagai nodul sebagian padat yang tidak pasti tanpa bukti penyebab jinak. Semua kasus ini diprediksi sebagai ganas menurut model pengklasifikasi (Tabel 1). Penilaian adenokarsinoma paru ditunjukkan oleh pemeriksaan histopatologi setelah operasi reseksi paru (Gambar 4b). Untuk set validasi eksternal, pengklasifikasi metabolik secara akurat memprediksi dua kasus nodul paru yang tidak pasti dengan ukuran lebih besar dari 6 mm (Gambar Tambahan 10).
Gambar CT dari jendela aksial paru-paru pada dua kasus nodul jinak. Pada kasus 1, CT scan setelah 4 tahun menunjukkan nodul padat stabil berukuran 7 mm dengan kalsifikasi di lobus bawah kanan. Pada kasus 2, CT scan setelah 5 tahun menunjukkan nodul stabil, sebagian padat dengan diameter 7 mm di lobus atas kanan. b Gambar CT jendela aksial paru-paru dan studi patologis yang sesuai dari dua kasus adenokarsinoma stadium I sebelum reseksi paru. Kasus 3 menunjukkan nodul dengan diameter 8 mm di lobus atas kanan dengan retraksi pleura. Kasus 4 menunjukkan nodul ground-glass sebagian padat berukuran 9 mm di lobus atas kiri. Pewarnaan hematoksilin dan eosin (H&E) pada jaringan paru yang direseksi (skala bar = 50 μm) menunjukkan pola pertumbuhan asinar adenokarsinoma paru. Panah menunjukkan nodul yang terdeteksi pada gambar CT. Gambar H&E adalah gambar representatif dari beberapa (>3) bidang mikroskopis yang diperiksa oleh ahli patologi.
Secara keseluruhan, hasil penelitian kami menunjukkan potensi nilai biomarker metabolit serum dalam diagnosis diferensial nodul paru, yang dapat menimbulkan tantangan saat mengevaluasi skrining CT.
Berdasarkan panel metabolit diferensial yang telah divalidasi, kami berupaya mengidentifikasi korelasi biologis dari perubahan metabolisme utama. Analisis pengayaan jalur KEGG oleh MetaboAnalyst mengidentifikasi 6 jalur yang berubah secara signifikan antara kedua kelompok yang diberikan (LA vs. HC dan LA vs. BN, p yang disesuaikan ≤ 0,001, efek > 0,01). Perubahan ini ditandai dengan gangguan pada metabolisme piruvat, metabolisme triptofan, metabolisme niasin dan nikotinamida, glikolisis, siklus TCA, dan metabolisme purin (Gambar 5a). Kami kemudian melakukan metabolomik terarah untuk memverifikasi perubahan utama menggunakan kuantifikasi absolut. Penentuan metabolit umum dalam jalur yang berubah secara umum dengan spektrometri massa kuadrupol rangkap tiga (QQQ) menggunakan standar metabolit otentik. Karakteristik demografis sampel target studi metabolomik disertakan dalam Tabel Tambahan 4. Konsisten dengan hasil metabolomik global kami, analisis kuantitatif mengkonfirmasi bahwa hipoxantin dan xantin, piruvat, dan laktat meningkat pada LA dibandingkan dengan BN dan HC (Gambar 5b, c, p <0,05). Namun, tidak ditemukan perbedaan signifikan pada metabolit ini antara BN dan HC.
Analisis pengayaan jalur KEGG dari metabolit yang berbeda secara signifikan pada kelompok LA dibandingkan dengan kelompok BN dan HC. Uji Global dua arah digunakan, dan nilai p disesuaikan menggunakan metode Holm-Bonferroni (p yang disesuaikan ≤ 0,001 dan ukuran efek > 0,01). b–d Plot biola yang menunjukkan kadar hipoxantin, xantin, laktat, piruvat, dan triptofan dalam serum HC, BN, dan LA yang ditentukan oleh LC-MS/MS (n = 70 per kelompok). Garis putus-putus putih dan hitam menunjukkan median dan kuartil, masing-masing. e Plot biola yang menunjukkan ekspresi mRNA Log2TPM (transkrip per juta) yang dinormalisasi dari SLC7A5 dan QPRT pada adenokarsinoma paru (n = 513) dibandingkan dengan jaringan paru normal (n = 59) dalam dataset LUAD-TCGA. Kotak putih mewakili rentang interkuartil, garis hitam horizontal di tengah mewakili median, dan garis hitam vertikal yang memanjang dari kotak mewakili interval kepercayaan 95% (CI). f Plot korelasi Pearson ekspresi SLC7A5 dan GAPDH pada adenokarsinoma paru (n = 513) dan jaringan paru normal (n = 59) dalam dataset TCGA. Area abu-abu mewakili CI 95%. r, koefisien korelasi Pearson. g Tingkat triptofan seluler yang dinormalisasi dalam sel A549 yang ditransfeksi dengan shRNA kontrol nonspesifik (NC) dan shSLC7A5 (Sh1, Sh2) yang ditentukan oleh LC-MS/MS. Analisis statistik dari lima sampel independen secara biologis di setiap kelompok disajikan. h Tingkat seluler NADt (total NAD, termasuk NAD+ dan NADH) dalam sel A549 (NC) dan sel A549 dengan penekanan SLC7A5 (Sh1, Sh2). Analisis statistik dari tiga sampel independen secara biologis di setiap kelompok disajikan. i Aktivitas glikolitik sel A549 sebelum dan setelah penekanan SLC7A5 diukur dengan laju pengasaman ekstraseluler (ECAR) (n = 4 sampel independen secara biologis per kelompok). 2-DG,2-deoksi-D-glukosa. Uji t Student dua arah digunakan pada (b–h). Pada (g–i), batang kesalahan mewakili rata-rata ± SD, setiap percobaan dilakukan tiga kali secara independen dan hasilnya serupa. Data sumber disediakan dalam bentuk berkas data sumber.
Mengingat dampak signifikan dari perubahan metabolisme triptofan pada kelompok LA, kami juga menilai kadar triptofan serum pada kelompok HC, BN, dan LA menggunakan QQQ. Kami menemukan bahwa triptofan serum berkurang pada LA dibandingkan dengan HC atau BN (p < 0,001, Gambar 5d), yang konsisten dengan temuan sebelumnya bahwa kadar triptofan yang beredar lebih rendah pada pasien kanker paru-paru dibandingkan dengan kontrol sehat dari kelompok kontrol33,34,35. Studi lain menggunakan pelacak PET/CT 11C-metil-L-triptofan menemukan bahwa waktu retensi sinyal triptofan dalam jaringan kanker paru-paru meningkat secara signifikan dibandingkan dengan lesi jinak atau jaringan normal36. Kami berhipotesis bahwa penurunan triptofan dalam serum LA mungkin mencerminkan penyerapan triptofan aktif oleh sel kanker paru-paru.
Diketahui juga bahwa produk akhir jalur kynurenine dari katabolisme triptofan adalah NAD+37,38, yang merupakan substrat penting untuk reaksi gliseraldehid-3-fosfat dengan 1,3-bisfosfogliserat dalam glikolisis39. Sementara penelitian sebelumnya berfokus pada peran katabolisme triptofan dalam regulasi imun, kami berupaya untuk menjelaskan interaksi antara disregulasi triptofan dan jalur glikolisis yang diamati dalam penelitian ini. Anggota keluarga transporter zat terlarut 7 (SLC7A5) diketahui sebagai transporter triptofan43,44,45. Asam kuinolinat fosforibosiltransferase (QPRT) adalah enzim yang terletak di hilir jalur kynurenine yang mengubah asam kuinolinat menjadi NAMN46. Pemeriksaan dataset LUAD TCGA mengungkapkan bahwa SLC7A5 dan QPRT keduanya secara signifikan meningkat pada jaringan tumor dibandingkan dengan jaringan normal (Gambar 5e). Peningkatan ini diamati pada stadium I dan II serta stadium III dan IV adenokarsinoma paru (Gambar Tambahan 11), yang menunjukkan gangguan awal dalam metabolisme triptofan yang terkait dengan tumorigenesis.
Selain itu, dataset LUAD-TCGA menunjukkan korelasi positif antara ekspresi mRNA SLC7A5 dan GAPDH pada sampel pasien kanker (r = 0,45, p = 1,55E-26, Gambar 5f). Sebaliknya, tidak ditemukan korelasi signifikan antara tanda gen tersebut pada jaringan paru normal (r = 0,25, p = 0,06, Gambar 5f). Penurunan ekspresi SLC7A5 (Gambar Tambahan 12) pada sel A549 secara signifikan mengurangi kadar triptofan dan NAD(H) seluler (Gambar 5g,h), yang mengakibatkan penurunan aktivitas glikolisis yang diukur dengan laju pengasaman ekstraseluler (ECAR) (Gambar 1i). Dengan demikian, berdasarkan perubahan metabolisme dalam serum dan deteksi in vitro, kami berhipotesis bahwa metabolisme triptofan dapat menghasilkan NAD+ melalui jalur kynurenin dan memainkan peran penting dalam meningkatkan glikolisis pada kanker paru.
Studi menunjukkan bahwa sejumlah besar nodul paru yang tidak pasti yang terdeteksi oleh LDCT dapat menyebabkan perlunya pengujian tambahan seperti PET-CT, biopsi paru, dan pengobatan berlebihan karena diagnosis positif palsu keganasan.31 Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 6, studi kami mengidentifikasi panel metabolit serum dengan nilai diagnostik potensial yang dapat meningkatkan stratifikasi risiko dan manajemen selanjutnya dari nodul paru yang terdeteksi oleh CT.
Nodul paru dievaluasi menggunakan tomografi komputer dosis rendah (LDCT) dengan gambaran pencitraan yang menunjukkan penyebab jinak atau ganas. Hasil yang tidak pasti dari nodul dapat menyebabkan kunjungan tindak lanjut yang sering, intervensi yang tidak perlu, dan pengobatan berlebihan. Penyertaan pengklasifikasi metabolik serum dengan nilai diagnostik dapat meningkatkan penilaian risiko dan manajemen nodul paru selanjutnya. PET (positron emission tomography).
Data dari studi NLST AS dan studi NELSON Eropa menunjukkan bahwa skrining kelompok berisiko tinggi dengan tomografi komputer dosis rendah (LDCT) dapat mengurangi angka kematian akibat kanker paru-paru1,3. Namun, penilaian risiko dan manajemen klinis selanjutnya dari sejumlah besar nodul paru insidental yang terdeteksi oleh LDCT tetap menjadi tantangan terbesar. Tujuan utamanya adalah untuk mengoptimalkan klasifikasi yang tepat dari protokol berbasis LDCT yang ada dengan menggabungkan biomarker yang andal.
Beberapa biomarker molekuler, seperti metabolit darah, telah diidentifikasi dengan membandingkan kanker paru-paru dengan kontrol sehat15,17. Dalam penelitian ini, kami berfokus pada penerapan analisis metabolomik serum untuk membedakan antara nodul paru jinak dan ganas yang secara kebetulan terdeteksi oleh LDCT. Kami membandingkan metabolom serum global dari sampel kontrol sehat (HC), nodul paru jinak (BN), dan adenokarsinoma paru stadium I (LA) menggunakan analisis UPLC-HRMS. Kami menemukan bahwa HC dan BN memiliki profil metabolik yang serupa, sedangkan LA menunjukkan perubahan signifikan dibandingkan dengan HC dan BN. Kami mengidentifikasi dua set metabolit serum yang membedakan LA dari HC dan BN.
Skema identifikasi nodul jinak dan ganas berbasis LDCT saat ini terutama didasarkan pada ukuran, kepadatan, morfologi, dan laju pertumbuhan nodul dari waktu ke waktu30. Studi sebelumnya telah menunjukkan bahwa ukuran nodul sangat berkaitan dengan kemungkinan kanker paru-paru. Bahkan pada pasien berisiko tinggi, risiko keganasan pada nodul <6 mm kurang dari 1%. Risiko keganasan untuk nodul berukuran 6 hingga 20 mm berkisar antara 8% hingga 64%30. Oleh karena itu, Fleischner Society merekomendasikan diameter batas 6 mm untuk tindak lanjut CT rutin. 29 Namun, penilaian risiko dan manajemen nodul paru yang tidak pasti (IPN) yang lebih besar dari 6 mm belum dilakukan secara memadai 31. Manajemen penyakit jantung bawaan saat ini biasanya didasarkan pada pengawasan ketat dengan pemantauan CT yang sering.
Berdasarkan metabolom yang telah divalidasi, kami menunjukkan untuk pertama kalinya adanya tumpang tindih tanda metabolomik antara individu sehat dan nodul jinak <6 mm. Kesamaan biologis ini konsisten dengan temuan CT sebelumnya bahwa risiko keganasan untuk nodul <6 mm sama rendahnya dengan subjek tanpa nodul.30 Perlu dicatat bahwa hasil kami juga menunjukkan bahwa nodul jinak <6 mm dan ≥6 mm memiliki kesamaan yang tinggi dalam profil metabolomik, menunjukkan bahwa definisi fungsional etiologi jinak konsisten terlepas dari ukuran nodul. Dengan demikian, panel metabolit serum diagnostik modern dapat memberikan satu pengujian sebagai tes penyingkiran ketika nodul pertama kali terdeteksi pada CT dan berpotensi mengurangi pemantauan serial. Pada saat yang sama, panel biomarker metabolik yang sama membedakan nodul ganas berukuran ≥6 mm dari nodul jinak dan memberikan prediksi akurat untuk IPN dengan ukuran serupa dan fitur morfologis yang ambigu pada citra CT. Klasifikasi metabolisme serum ini menunjukkan kinerja yang baik dalam memprediksi keganasan nodul ≥6 mm dengan AUC sebesar 0,927. Secara keseluruhan, hasil kami menunjukkan bahwa tanda metabolomik serum yang unik dapat secara spesifik mencerminkan perubahan metabolisme yang diinduksi tumor pada tahap awal dan memiliki potensi nilai sebagai prediktor risiko, terlepas dari ukuran nodul.
Perlu dicatat bahwa adenokarsinoma paru (LUAD) dan karsinoma sel skuamosa (LUSC) adalah jenis utama kanker paru non-sel kecil (NSCLC). Mengingat bahwa LUSC sangat terkait dengan penggunaan tembakau47 dan LUAD adalah histologi paling umum dari nodul paru insidental yang terdeteksi pada skrining CT48, model pengklasifikasi kami secara khusus dibangun untuk sampel adenokarsinoma stadium I. Wang dan rekan-rekannya juga berfokus pada LUAD dan mengidentifikasi sembilan tanda lipid menggunakan lipidomik untuk membedakan kanker paru stadium awal dari individu sehat17. Kami menguji model pengklasifikasi saat ini pada 16 kasus LUSC stadium I dan 74 nodul jinak dan mengamati akurasi prediksi LUSC yang rendah (AUC 0,776), menunjukkan bahwa LUAD dan LUSC mungkin memiliki tanda metabolomiknya sendiri. Memang, LUAD dan LUSC telah terbukti berbeda dalam etiologi, asal biologis, dan aberasi genetik49. Oleh karena itu, jenis histologi lain harus dimasukkan dalam model pelatihan untuk deteksi kanker paru-paru berbasis populasi dalam program skrining.
Di sini, kami mengidentifikasi enam jalur yang paling sering mengalami perubahan pada adenokarsinoma paru dibandingkan dengan kontrol sehat dan nodul jinak. Xantin dan hipoxantin adalah metabolit umum dari jalur metabolisme purin. Konsisten dengan hasil kami, intermediet yang terkait dengan metabolisme purin meningkat secara signifikan dalam serum atau jaringan pasien dengan adenokarsinoma paru dibandingkan dengan kontrol sehat atau pasien pada tahap pra-invasif15,50. Peningkatan kadar xantin dan hipoxantin serum dapat mencerminkan anabolisme yang dibutuhkan oleh sel kanker yang berkembang biak dengan cepat. Disregulasi metabolisme glukosa adalah ciri khas metabolisme kanker yang sudah dikenal51. Di sini, kami mengamati peningkatan signifikan pada piruvat dan laktat pada kelompok LA dibandingkan dengan kelompok HC dan BN, yang konsisten dengan laporan sebelumnya tentang kelainan jalur glikolisis dalam profil metabolom serum pasien kanker paru non-sel kecil (NSCLC) dan kontrol sehat. Hasilnya konsisten52,53.
Yang penting, kami mengamati korelasi terbalik antara metabolisme piruvat dan triptofan dalam serum adenokarsinoma paru. Kadar triptofan serum berkurang pada kelompok LA dibandingkan dengan kelompok HC atau BN. Menariknya, sebuah studi skala besar sebelumnya menggunakan kohort prospektif menemukan bahwa kadar triptofan yang rendah dalam sirkulasi dikaitkan dengan peningkatan risiko kanker paru 54. Triptofan adalah asam amino esensial yang kita peroleh sepenuhnya dari makanan. Kami menyimpulkan bahwa penipisan triptofan serum pada adenokarsinoma paru mungkin mencerminkan penipisan cepat metabolit ini. Sudah diketahui bahwa produk akhir katabolisme triptofan melalui jalur kynurenin adalah sumber sintesis NAD+ de novo. Karena NAD+ diproduksi terutama melalui jalur penyelamatan, pentingnya NAD+ dalam metabolisme triptofan dalam kesehatan dan penyakit masih perlu ditentukan46. Analisis kami terhadap basis data TCGA menunjukkan bahwa ekspresi transporter triptofan solute transporter 7A5 (SLC7A5) meningkat secara signifikan pada adenokarsinoma paru dibandingkan dengan kontrol normal dan berkorelasi positif dengan ekspresi enzim glikolitik GAPDH. Studi sebelumnya sebagian besar berfokus pada peran katabolisme triptofan dalam menekan respons imun antitumor40,41,42. Di sini kami menunjukkan bahwa penghambatan penyerapan triptofan melalui penonaktifan SLC7A5 pada sel kanker paru mengakibatkan penurunan kadar NAD seluler dan pelemahan aktivitas glikolitik secara bersamaan. Singkatnya, studi kami memberikan dasar biologis untuk perubahan metabolisme serum yang terkait dengan transformasi ganas adenokarsinoma paru.
Mutasi EGFR merupakan mutasi pendorong yang paling umum pada pasien NSCLC. Dalam penelitian kami, kami menemukan bahwa pasien dengan mutasi EGFR (n = 41) memiliki profil metabolomik secara keseluruhan yang mirip dengan pasien dengan EGFR tipe liar (n = 31), meskipun kami menemukan penurunan kadar serum beberapa pasien mutan EGFR pada pasien asilcarnitin. Fungsi asilcarnitin yang telah ditetapkan adalah untuk mengangkut gugus asil dari sitoplasma ke matriks mitokondria, yang mengarah pada oksidasi asam lemak untuk menghasilkan energi 55. Konsisten dengan temuan kami, sebuah studi baru-baru ini juga mengidentifikasi profil metabolom yang serupa antara tumor mutan EGFR dan tumor EGFR tipe liar dengan menganalisis metabolom global dari 102 sampel jaringan adenokarsinoma paru-paru50. Menariknya, kandungan asilcarnitin juga ditemukan pada kelompok mutan EGFR. Oleh karena itu, apakah perubahan kadar asilcarnitin mencerminkan perubahan metabolisme yang diinduksi EGFR dan jalur molekuler yang mendasarinya mungkin perlu diteliti lebih lanjut.
Kesimpulannya, penelitian kami menetapkan pengklasifikasi metabolik serum untuk diagnosis diferensial nodul paru dan mengusulkan alur kerja yang dapat mengoptimalkan penilaian risiko dan memfasilitasi manajemen klinis berdasarkan skrining CT scan.
Penelitian ini telah disetujui oleh Komite Etika Rumah Sakit Kanker Universitas Sun Yat-sen, Rumah Sakit Afiliasi Pertama Universitas Sun Yat-sen, dan Komite Etika Rumah Sakit Kanker Universitas Zhengzhou. Pada kelompok penemuan dan validasi internal, 174 serum dari individu sehat dan 244 serum dari nodul jinak dikumpulkan dari individu yang menjalani pemeriksaan medis tahunan di Departemen Pengendalian dan Pencegahan Kanker, Pusat Kanker Universitas Sun Yat-sen, dan 166 serum nodul jinak. Adenokarsinoma paru stadium I dikumpulkan dari Pusat Kanker Universitas Sun Yat-sen. Pada kohort validasi eksternal, terdapat 48 kasus nodul jinak, 39 kasus adenokarsinoma paru stadium I dari Rumah Sakit Afiliasi Pertama Universitas Sun Yat-sen, dan 24 kasus adenokarsinoma paru stadium I dari Rumah Sakit Kanker Zhengzhou. Pusat Kanker Universitas Sun Yat-sen juga mengumpulkan 16 kasus kanker paru sel skuamosa stadium I untuk menguji kemampuan diagnostik pengklasifikasi metabolik yang telah ditetapkan (karakteristik pasien ditunjukkan pada Tabel Tambahan 5). Sampel dari kohort penemuan dan kohort validasi internal dikumpulkan antara Januari 2018 dan Mei 2020. Sampel untuk kohort validasi eksternal dikumpulkan antara Agustus 2021 dan Oktober 2022. Untuk meminimalkan bias gender, jumlah kasus laki-laki dan perempuan yang hampir sama dialokasikan ke setiap kohort. Tim Penemuan dan Tim Peninjauan Internal. Jenis kelamin peserta ditentukan berdasarkan laporan diri. Persetujuan informed consent diperoleh dari semua peserta dan tidak ada kompensasi yang diberikan. Subjek dengan nodul jinak adalah mereka yang memiliki skor CT scan stabil pada 2 hingga 5 tahun pada saat analisis, kecuali untuk 1 kasus dari sampel validasi eksternal, yang dikumpulkan sebelum operasi dan didiagnosis dengan histopatologi. Dengan pengecualian bronkitis kronis. Kasus adenokarsinoma paru dikumpulkan sebelum reseksi paru dan dikonfirmasi oleh diagnosis patologis. Sampel darah puasa dikumpulkan dalam tabung pemisah serum tanpa antikoagulan. Sampel darah dibiarkan menggumpal selama 1 jam pada suhu kamar dan kemudian disentrifugasi pada 2851 × g selama 10 menit pada suhu 4°C untuk mengumpulkan supernatan serum. Aliquot serum dibekukan pada suhu -80°C hingga ekstraksi metabolit. Departemen Pencegahan Kanker dan Pemeriksaan Medis Pusat Kanker Universitas Sun Yat-sen mengumpulkan kumpulan serum dari 100 donor sehat, termasuk jumlah pria dan wanita yang sama berusia 40 hingga 55 tahun. Volume yang sama dari setiap sampel donor dicampur, kumpulan yang dihasilkan kemudian dibagi menjadi beberapa alikuot dan disimpan pada suhu -80°C. Campuran serum tersebut digunakan sebagai bahan referensi untuk kontrol kualitas dan standardisasi data.
Serum referensi dan sampel uji dicairkan dan metabolit diekstraksi menggunakan metode ekstraksi gabungan (MTBE/metanol/air) 56. Secara singkat, 50 μl serum dicampur dengan 225 μl metanol dingin dan 750 μl metil tert-butil eter (MTBE) dingin. Aduk campuran dan inkubasi di atas es selama 1 jam. Sampel kemudian dicampur dan di-vortex dengan 188 μl air murni MS yang mengandung standar internal (13C-laktat, 13C3-piruvat, 13C-metionin, dan 13C6-isoleusin, dibeli dari Cambridge Isotope Laboratories). Campuran kemudian disentrifugasi pada 15.000 × g selama 10 menit pada suhu 4 °C, dan fase bawah dipindahkan ke dalam dua tabung (masing-masing 125 μL) untuk analisis LC-MS dalam mode positif dan negatif. Terakhir, sampel diuapkan hingga kering dalam konsentrator vakum berkecepatan tinggi.
Metabolit kering dilarutkan kembali dalam 120 μl asetonitril 80%, di-vortex selama 5 menit, dan disentrifugasi pada 15.000 × g selama 10 menit pada suhu 4°C. Supernatan dipindahkan ke dalam vial kaca amber dengan mikroinsert untuk studi metabolomik. Analisis metabolomik tanpa target pada platform kromatografi cair kinerja ultra-spektrometri massa resolusi tinggi (UPLC-HRMS). Metabolit dipisahkan menggunakan sistem UPLC Dionex Ultimate 3000 dan kolom ACQUITY BEH Amide (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters). Dalam mode ion positif, fase gerak adalah 95% (A) dan 50% asetonitril (B), masing-masing mengandung 10 mmol/L amonium asetat dan 0,1% asam format. Dalam mode negatif, fase gerak A dan B masing-masing mengandung 95% dan 50% asetonitril, kedua fase tersebut mengandung 10 mmol/L amonium asetat, pH = 9. Program gradiennya adalah sebagai berikut: 0–0,5 menit, 2% B; 0,5–12 menit, 2–50% B; 12–14 menit, 50–98% B; 14–16 menit, 98% B; 16–16,1 menit, 98–2% B; 16,1–20 menit, 2% B. Kolom dipertahankan pada suhu 40°C dan sampel pada suhu 10°C di dalam autosampler. Laju alir adalah 0,3 ml/menit, volume injeksi adalah 3 μl. Spektrometer massa Q-Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) dengan sumber ionisasi elektrospray (ESI) dioperasikan dalam mode pemindaian penuh dan digabungkan dengan mode pemantauan ddMS2 untuk mengumpulkan data dalam jumlah besar. Parameter MS diatur sebagai berikut: tegangan semprot +3,8 kV/- 3,2 kV, suhu kapiler 320°C, gas pelindung 40 arb, gas bantu 10 arb, suhu pemanas probe 350°C, rentang pemindaian 70–1050 m/jam, resolusi 70.000. Data diperoleh menggunakan Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Untuk menilai kualitas data, sampel kontrol kualitas (QC) gabungan dihasilkan dengan mengambil 10 μL alikuot supernatan dari setiap sampel. Enam injeksi sampel kontrol kualitas dianalisis pada awal rangkaian analitik untuk menilai stabilitas sistem UPLC-MS. Sampel kontrol kualitas kemudian secara berkala dimasukkan ke dalam batch. Semua 11 batch sampel serum dalam penelitian ini dianalisis dengan LC-MS. Alikuot campuran serum dari 100 donor sehat digunakan sebagai bahan referensi dalam masing-masing batch untuk memantau proses ekstraksi dan menyesuaikan efek antar batch. Analisis metabolomik tak bertarget dari kohort penemuan, kohort validasi internal, dan kohort validasi eksternal dilakukan di Pusat Metabolomik Universitas Sun Yat-sen. Laboratorium eksternal Pusat Analisis dan Pengujian Universitas Teknologi Guangdong juga menganalisis 40 sampel dari kohort eksternal untuk menguji kinerja model pengklasifikasi.
Setelah ekstraksi dan rekonstitusi, kuantifikasi absolut metabolit serum diukur menggunakan kromatografi cair kinerja ultra tinggi-spektrometri massa tandem (Agilent 6495 triple quadrupole) dengan sumber ionisasi elektrospray (ESI) dalam mode pemantauan reaksi ganda (MRM). Kolom ACQUITY BEH Amide (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters) digunakan untuk memisahkan metabolit. Fase gerak terdiri dari 90% (A) dan 5% asetonitril (B) dengan 10 mmol/L amonium asetat dan larutan amonia 0,1%. Program gradien adalah sebagai berikut: 0–1,5 menit, 0% B; 1,5–6,5 menit, 0–15% B; 6,5–8 menit, 15% B; 8–8,5 menit, 15%–0% B; 8,5–11,5 menit, 0% B. Kolom dipertahankan pada suhu 40 °C dan sampel pada suhu 10 °C di dalam autosampler. Laju alir adalah 0,3 mL/min dan volume injeksi adalah 1 μL. Parameter MS diatur sebagai berikut: tegangan kapiler ±3,5 kV, tekanan nebulizer 35 psi, laju alir gas selubung 12 L/min, suhu gas selubung 350°C, suhu gas pengering 250°C, dan laju alir gas pengering 14 l/min. Konversi MRM triptofan, piruvat, laktat, hipoxantin, dan xantin masing-masing adalah 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3, dan 151,0–107,9. Data dikumpulkan menggunakan Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies). Untuk sampel serum, triptofan, piruvat, laktat, hipoxantin, dan xantin diukur menggunakan kurva kalibrasi dari larutan campuran standar. Untuk sampel sel, kandungan triptofan dinormalisasi terhadap standar internal dan massa protein sel.
Ekstraksi puncak (m/z dan waktu retensi (RT)) dilakukan menggunakan Compound Discovery 3.1 dan TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific). Untuk menghilangkan potensi perbedaan antar batch, setiap puncak karakteristik sampel uji dibagi dengan puncak karakteristik bahan referensi dari batch yang sama untuk mendapatkan kelimpahan relatif. Deviasi standar relatif dari standar internal sebelum dan sesudah standardisasi ditunjukkan pada Tabel Tambahan 6. Perbedaan antara kedua kelompok dikarakterisasi oleh tingkat penemuan palsu (FDR<0,05, uji peringkat bertanda Wilcoxon) dan perubahan lipatan (>1,2 atau <0,83). Data MS mentah dari fitur yang diekstrak dan data MS yang dikoreksi serum referensi ditunjukkan pada Data Tambahan 1 dan Data Tambahan 2, masing-masing. Anotasi puncak dilakukan berdasarkan empat tingkat identifikasi yang ditentukan, termasuk metabolit yang teridentifikasi, senyawa yang diduga dianotasi, kelas senyawa yang diduga dikarakterisasi, dan senyawa yang tidak diketahui 22. Berdasarkan pencarian basis data di Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider), senyawa biologis dengan kecocokan MS/MS dengan standar yang divalidasi atau anotasi kecocokan tepat di mzCloud (skor > 85) atau Chemspider akhirnya dipilih sebagai perantara antara metabolom diferensial. Anotasi puncak untuk setiap fitur disertakan dalam Data Tambahan 3. MetaboAnalyst 5.0 digunakan untuk analisis univariat dari kelimpahan metabolit yang dinormalisasi jumlah. MetaboAnalyst 5.0 juga mengevaluasi analisis pengayaan jalur KEGG berdasarkan metabolit yang berbeda secara signifikan. Analisis komponen utama (PCA) dan analisis diskriminan kuadrat terkecil parsial (PLS-DA) dianalisis menggunakan paket perangkat lunak ropls (v.1.26.4) dengan normalisasi tumpukan dan penskalaan otomatis. Model biomarker metabolit optimal untuk memprediksi keganasan nodul dihasilkan menggunakan regresi logistik biner dengan operator penyusutan dan seleksi absolut terkecil (LASSO, paket R v.4.1-3). Kinerja model diskriminan pada set deteksi dan validasi dikarakterisasi dengan memperkirakan AUC berdasarkan analisis ROC sesuai dengan paket pROC (v.1.18.0.). Ambang batas probabilitas optimal diperoleh berdasarkan indeks Youden maksimum dari model (sensitivitas + spesifisitas – 1). Sampel dengan nilai kurang atau lebih besar dari ambang batas akan diprediksi sebagai nodul jinak dan adenokarsinoma paru-paru, masing-masing.
Sel A549 (#CCL-185, American Type Culture Collection) ditumbuhkan dalam medium F-12K yang mengandung 10% FBS. Sekuens RNA hairpin pendek (shRNA) yang menargetkan SLC7A5 dan kontrol non-target (NC) dimasukkan ke dalam vektor lentiviral pLKO.1-puro. Sekuens antisense shSLC7A5 adalah sebagai berikut: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′). Antibodi terhadap SLC7A5 (#5347) dan tubulin (#2148) dibeli dari Cell Signaling Technology. Antibodi terhadap SLC7A5 dan tubulin digunakan pada pengenceran 1:1000 untuk analisis Western blot.
Tes Stres Glikolitik Seahorse XF mengukur tingkat pengasaman ekstraseluler (ECAR). Dalam pengujian ini, glukosa, oligomisin A, dan 2-DG diberikan secara berurutan untuk menguji kapasitas glikolisis seluler yang diukur dengan ECAR.
Sel A549 yang ditransfeksi dengan kontrol non-target (NC) dan shSLC7A5 (Sh1, Sh2) diinokulasi semalaman dalam cawan berdiameter 10 cm. Metabolit sel diekstraksi dengan 1 ml metanol berair 80% dingin. Sel dalam larutan metanol dikerok, dikumpulkan ke dalam tabung baru, dan disentrifugasi pada 15.000 × g selama 15 menit pada suhu 4°C. Kumpulkan 800 µl supernatan dan keringkan menggunakan konsentrator vakum berkecepatan tinggi. Pelet metabolit kering kemudian dianalisis kadar triptofannya menggunakan LC-MS/MS seperti yang dijelaskan di atas. Kadar NAD(H) seluler dalam sel A549 (NC dan shSLC7A5) diukur menggunakan kit kolorimetri NAD+/NADH kuantitatif (#K337, BioVision) sesuai petunjuk pabrik. Kadar protein diukur untuk setiap sampel untuk menormalkan jumlah metabolit.
Tidak ada metode statistik yang digunakan untuk menentukan ukuran sampel secara awal. Studi metabolomik sebelumnya yang bertujuan untuk penemuan biomarker15,18 telah dianggap sebagai tolok ukur untuk penentuan ukuran, dan dibandingkan dengan laporan-laporan ini, sampel kami memadai. Tidak ada sampel yang dikeluarkan dari kohort penelitian. Sampel serum secara acak ditugaskan ke kelompok penemuan (306 kasus, 74,6%) dan kelompok validasi internal (104 kasus, 25,4%) untuk studi metabolomik tanpa target. Kami juga secara acak memilih 70 kasus dari setiap kelompok dari set penemuan untuk studi metabolomik bertarget. Para peneliti tidak mengetahui penugasan kelompok selama pengumpulan dan analisis data LC-MS. Analisis statistik data metabolomik dan eksperimen sel dijelaskan dalam bagian Hasil, Keterangan Gambar, dan Metode masing-masing. Kuantifikasi triptofan seluler, NADT, dan aktivitas glikolitik dilakukan tiga kali secara independen dengan hasil yang identik.
Untuk informasi lebih lanjut mengenai desain penelitian, lihat Abstrak Laporan Portofolio Alam yang terkait dengan artikel ini.
Data MS mentah dari fitur yang diekstrak dan data MS yang dinormalisasi dari serum referensi ditunjukkan pada Data Tambahan 1 dan Data Tambahan 2, masing-masing. Anotasi puncak untuk fitur diferensial disajikan pada Data Tambahan 3. Dataset LUAD TCGA dapat diunduh dari https://portal.gdc.cancer.gov/. Data masukan untuk pembuatan grafik disediakan dalam data sumber. Data sumber disediakan untuk artikel ini.
Kelompok Studi Skrining Paru Nasional, dsb. Mengurangi angka kematian akibat kanker paru dengan tomografi komputer dosis rendah. Inggris Utara. J. Med. 365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR dan Prophet, PC Pemeriksaan kanker paru menggunakan CT heliks dosis rendah: hasil dari Studi Pemeriksaan Paru Nasional (NLST). J. Med. Screen 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ, dkk. Mengurangi angka kematian akibat kanker paru-paru dengan skrining CT volumetrik dalam uji coba acak. Inggris Utara. J. Med. 382, 503–513 (2020).
Waktu posting: 18 September 2023