CRISPR adalah teknik pengeditan genom generasi ketiga: CRISPR merevolusi dunia.

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) adalah teknik pengeditan genom generasi ketiga yang telah merevolusi dunia dengan hasil berkecepatan tinggi. Teknik ini telah digunakan untuk mengobati berbagai penyakit dan infeksi biologis. Berbagai bakteri dan prokariota lainnya (seperti archaea) juga memiliki sistem CRISPR/Cas9 untuk bertahan melawan fag. Telah dilaporkan bahwa strategi berbasis CRISPR/Cas9 dapat menghambat pertumbuhan dan perkembangan kanker payudara triple negatif (TNBC) dengan menargetkan gen resistensi yang berpotensi berubah, transkripsi, dan regulasi epigenetik. Intervensi terapeutik ini dapat membantu mengatasi masalah yang menantang seperti resistensi obat yang diamati bahkan pada TNBC. Saat ini, berbagai metode digunakan untuk mengirimkan CRISPR/Cas9 ke sel target, seperti metode fisik (mikroinjeksi, elektroporasi, dan hidrodinamik), virus (virus adeno-associated dan lentivirus), dan non-virus (liposom dan nanopartikel lipid). Meskipun berbagai model telah dikembangkan untuk mempelajari penyebab molekuler TNBC, kurangnya metode yang sensitif dan terarah untuk memberikan alat pengeditan genom secara in vivo membatasi aplikasi klinisnya. Singkatnya, tinjauan ini secara komprehensif mengkaji kemajuan, tantangan, keterbatasan, dan prospek pengobatan CRISPR/Cas9 untuk TNBC berdasarkan bukti yang ada. Kami juga menyoroti bagaimana kombinasi kecerdasan buatan dan pembelajaran mesin dapat meningkatkan strategi CRISPR/Cas9 dalam pengobatan TNBC.
Kanker ditandai dengan pembelahan sel yang tidak terkontrol, gangguan titik kontrol siklus sel, dan mutasi pada gen penekan tumor (TSG) (Matthews dkk., 2022). Di antara berbagai jenis kanker, kanker payudara adalah jenis kanker yang paling umum pada wanita dan memiliki angka kematian yang tinggi di seluruh dunia (Waks dan Winer, 2019). Kanker payudara adalah penyakit heterogen dengan karakteristik yang beragam, seperti fitur histologis dan biologis, presentasi dan perilaku klinis, serta respons terhadap pengobatan (Weigelt dkk., 2010). Klasifikasi kanker payudara memberikan wawasan yang tepat untuk diagnosis kanker payudara dan prognosis tumor. Penggunaan biomarker umum dan fitur klinikopatologis telah menjadi kriteria utama untuk klasifikasi kanker payudara (Tsang dan Tse, 2019). Prognosis dan respons terhadap pengobatan kanker payudara dipengaruhi oleh banyak faktor, termasuk keberadaan reseptor estrogen (ER), reseptor progesteron (PR), reseptor faktor pertumbuhan epidermal manusia 2 (HER2/neu), dan tingkat histologis, jenis tumor, dan derajatnya. ukuran dan metastasis kelenjar getah bening (Al-Tubaiti, 2020). Lima subtipe molekuler intrinsik kanker payudara telah diidentifikasi, termasuk luminal A, luminal B, HER2-enriched, basal-like, dan claudin-low (Prat et al., 2015). TNBC adalah subtipe molekuler kanker yang tidak mengekspresikan semua ER, PR, dan HER2 (Yin et al., 2020). Ciri-ciri patologis ini terkait dengan TNBC, yang menegaskan perkembangannya yang cepat dan sifatnya yang lebih agresif daripada jenis kanker payudara lainnya (Feng et al., 2018). Selain itu, Peru et al (2000) menggunakan teknologi microarray untuk mengklasifikasikan ulang kanker payudara dan mengidentifikasi lima subtipe intrinsik kanker payudara (Cadenas, 2012). Kanker payudara basal-like adalah subtipe kanker payudara yang memiliki fenotipe triple-negative dan dikaitkan dengan perkembangan yang cepat. Perlu dicatat bahwa semua kanker payudara tipe basal sering salah didiagnosis sebagai TNBC, tetapi hanya 77% yang merupakan TNBC; Sebaliknya, 71–91% dari TNBC adalah tipe basal, menunjukkan bahwa kedua jenis kanker payudara ini tumpang tindih dan mewakili klasifikasi yang berbeda (Wang D.-Y. dkk., 2019). Hal ini menciptakan kebutuhan untuk mengkarakterisasi heterogenitas TNBC untuk menjelaskan prognosis dan mengidentifikasi potensi respons terhadap pengobatan saat ini dan di masa mendatang. Selain itu, TNBC mencakup 15–20% dari semua kasus kanker payudara dan lebih umum terjadi pada wanita di bawah usia 50 tahun. Mutasi BRCA1 atau BRCA2 telah dilaporkan pada sekitar 20% kasus TNBC (Xie dkk., 2017; Tzikas dkk., 2017). Penelitian juga menunjukkan bahwa TNBC memiliki lingkungan mikro imun yang khas yang mencakup tingkat faktor pertumbuhan endotel vaskular yang tinggi, makrofag terkait tumor (TAM), limfosit infiltrasi tumor (TIL), dan molekul lain yang terlibat dalam pertumbuhan dan migrasi tumor. Oleh karena itu, pemahaman tentang lingkungan mikro TNBC sangat penting untuk prognosis dan pengobatannya (Fan dan He, 2022).
Untuk menilai prognosis TNBC dan memastikan pengobatan yang efektif, diagnosis yang akurat, terutama berdasarkan imunohistokimia (IHC) untuk mendeteksi ER, PR, dan HER2, serta mammografi untuk mendeteksi neoplasma payudara, sangat penting. Namun, mammografi tidak dapat menggambarkan fitur intratumoral seperti nekrosis dan fibrosis secara memadai (Deepak Singh dkk., 2021). Karena prognosis dan diagnosis yang buruk mencegah dokter meresepkan obat yang tepat (Chaudhary, 2020), berbagai strategi digunakan untuk meningkatkan perawatan pasien dengan TNBC. Saat ini, dua obat, doxorubicin dan cyclophosphamide, digunakan pada pasien dengan TNBC dan telah menunjukkan hasil yang baik. Selain itu, obat platinum lainnya juga digunakan, seperti carboplatin dan cisplatin (Sikov dkk., 2015). Selain itu, inhibitor PARP seperti Olaparib, Velaparib, dan PF-01367338 telah digunakan sebagai obat kemoterapi potensial untuk pengobatan TNBC (Ishino et al., 2018). Karena jalur pensinyalan Wnt/β-Catenin, NOTCH, dan Hedgehog dilaporkan terlibat dalam terjadinya dan perkembangan TNBC, menargetkan obat ke jalur-jalur ini mungkin merupakan strategi penting (Aysola et al., 2013). Meskipun pembedahan, radioterapi, dan kemoterapi tetap menjadi andalan pengobatan untuk TNBC saat ini, kemajuan signifikan telah dicapai dalam pengembangan pengobatan baru termasuk terapi target, imunoterapi, berbagai alat pengeditan gen terkait CRISPR seperti Cas9n, dCas9, CRISPR/Cas12, pengeditan primer, dan terapi gen target CRISPR/Cas9. Di sini kita akan fokus pada berbagai alat pengeditan gen terkait CRISPR yang digunakan dalam pengobatan TNBC. Di antara berbagai metode tersebut, CRISPR/Cas9 telah mendapat perhatian luas.
Cas9n, juga dikenal sebagai Cas9 nickase, adalah varian protein Cas9 hasil rekayasa genetika yang berasal dari sistem pengeditan genom CRISPR/Cas9 (Gupta et al., 2019). Dalam bentuk aslinya, protein Cas9 mengandung dua domain nuklease: RuvC dan HNH, yang fungsi utamanya adalah memotong kedua untai DNA. Namun, pada Cas9n, salah satu domain nuklease, HNH, mengalami mutasi genetik dan menjadi tidak aktif. Oleh karena itu, domain HNH dari Cas9n tetap tidak berfungsi. Hanya domain RuvC yang tetap aktif, memungkinkan Cas9n untuk memotong atau membuat putus pada untai DNA tunggal (Trevino dan Zhang, 2014). Dibandingkan dengan Cas9, Cas9n dapat secara efektif mengurangi efek di luar target dan secara akurat meningkatkan mekanisme perbaikan sel. Cas9n dapat digunakan untuk memecahkan berbagai masalah, seperti membuat putus pada lokasi spesifik dalam DNA untai ganda. Untuk tujuan ini, dua molekul Cas9n digabungkan dan digunakan bersama (Yee, 2016). Mixed lineage kinase 3 (MLK3) adalah kinase protein yang diaktifkan oleh mitogen yang berfungsi sebagai regulator kunci selama metastasis TNBC (Cronan et al., 2012).
MLK3 dapat mengaktifkan berbagai jalur pensinyalan yang mengarah pada metastasis TNBC. Misalnya, jalur c-Jun N-terminal kinase (JNK) mengatur motilitas sel dan degradasi matriks ekstraseluler, dan MLK3 mengaktifkan jalur JNK, sehingga meningkatkan motilitas sel dan memberikan sifat invasif (Rattanasinchai dan Gallo, 2016). MLK3 juga mengatur EMT. Untuk melakukan ini, ia mengaktifkan faktor transkripsi hilir seperti Snail, Slug, dan Twist. Faktor-faktor ini menghambat ekspresi penanda epitel dan mendorong ekspresi penanda mesenkim, yang mengarah pada perolehan fenotipe metastatik (Casalino dkk., 2023). MLK3 telah diamati berperan dalam remodeling ECM dan aktivasi protease seperti matriks metaloproteinase (MMP) yang mendegradasi ECM. Hal ini memfasilitasi invasi sel tumor dan penyebarannya ke lokasi yang jauh (Katari dkk., 2019). Dengan demikian, penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa MLK3 memainkan peran penting dalam TNBC. Rattanasinchai dan Gallo menggunakan model TNBC untuk mempelajari peran MLK3 dan menemukan bahwa MLK3 mendorong perkembangan kanker melalui jalur pensinyalan spesifik. Mereka menggunakan CRISPR/Cas9n untuk mengedit MLK3 dan mengamati pengurangan signifikan dalam metastasis TNBC (Rattanasinchai dan Gallo, 2016).
dCas9, yang sering disebut Cas9 tidak aktif, adalah bentuk turunan yang dimodifikasi dari protein Cas9. Tidak seperti Cas9 aktif, dCas9 tidak memiliki aktivitas endonuklease, sehingga tidak mampu menginduksi kerusakan untai ganda DNA. Oleh karena itu, dCas9 dapat digunakan untuk menargetkan secara tepat wilayah spesifik genom tanpa perubahan atau modifikasi pada sekuens DNA (Wang et al., 2016). Pada dCas9, dua protein endonuklease, RuvC dan HNH, dinonaktifkan dengan menekan residu asam amino penting (Richter et al., 2016). Meskipun tidak memiliki aktivitas pemutusan DNA, dCas9 memainkan sejumlah peran penting dalam penelitian genetika dan bioteknologi. Misalnya, memungkinkan visualisasi wilayah spesifik genom, memfasilitasi regulasi transkripsi, dan mendorong modifikasi epigenetik (Brocken et al., 2018).
Faktor transkripsi ZEB1 (zinc finger E-box binding homeobox 1) memainkan peran spesifik dan penting dalam memediasi transisi epitel-mesenkim (EMT), suatu proses seluler yang terjadi selama perkembangan embrio, perbaikan jaringan, dan perkembangan kanker. Proses ini melibatkan transformasi sel epitel menjadi sel mesenkim, yang mengakibatkan perubahan morfologi sel, motilitas, invasivitas, dan lain-lain (Wu et al., 2020). ZEB1 menghambat beberapa penanda epitel, seperti E-cadherin dan Occludin, yang bertanggung jawab untuk mempertahankan adhesi sel-sel dan polaritas sel epitel pada TNBC (Moreno-Bueno et al., 2008). Selain itu, ZEB1 mengaktifkan penanda tertentu seperti N-cadherin, vimentin, dan fibronectin (Konradi dkk., 2014) dan juga mengatur gen yang terlibat dalam remodeling sitoskeleton seperti Rho GTPase dan matriks metalloproteinase (MMP) (Huang dkk., 2014). 2022), selain itu, ia juga memengaruhi berbagai jalur pensinyalan seperti transforming growth factor-β (TGF-β), pensinyalan Wnt, dll., sehingga mendorong invasi dan metastasis tumor pada TNBC (Chen dkk., 2016). Banyak penelitian dan bukti ilmiah menunjukkan bahwa ZEB1 memiliki potensi besar sebagai agen berharga untuk deteksi dan intervensi terapeutik TNBC. Dalam sebuah penelitian baru-baru ini, Waryah dkk. menggunakan model TNBC dan mencapai penekanan ZEB1 secara lengkap oleh dCas9. Dengan demikian, mereka mengamati spesifisitas yang sangat tinggi dan penghambatan ZEB1 yang hampir sempurna dalam kondisi in vivo (Waryah et al., 2023).
CRISPR/Cas12 adalah alat pengeditan gen yang disebut CRISPR/Cpf1. Alat ini berasal dari sistem CRISPR/Cas, di mana istilah Cas12 merujuk pada protein terkait CRISPR 12 (Bharathkumar dkk., 2022), yang sepenuhnya mirip dengan Cas9. Satu-satunya perbedaan adalah bahwa ia mengandung protein Cas12. Dibandingkan dengan Cas9, Cas12 memiliki beberapa fungsi unik seperti menghasilkan ujung lengket selama proses pengeditan gen, sedangkan Cas9 menghasilkan ujung tumpul (Wang dkk., 2021). Sifat Cas12 ini berkontribusi pada teknologi manipulasi DNA spesifiknya. Sebagai protein yang mampu mengenali dan memotong DNA target secara tepat, ia memiliki fleksibilitas luar biasa, menjadikannya alat yang efektif untuk berbagai aplikasi, termasuk pengeditan gen (Pickar-Oliver dan Gersbach, 2019).
Mirip dengan varian CRISPR lainnya, CRISPR/Cas12 juga mampu menonaktifkan atau mengaktifkan gen pada TNBC, menargetkan gen yang memainkan peran penting dalam patogenesis atau respons terhadap pengobatan (Yang dan Zhang, 2023). Untuk mencapai proses ini, dikembangkan RNA pemandu (gRNA) yang mengarahkan Cas12 ke gen target. Setelah Cas12 berikatan dengan targetnya, ia menyebabkan kerusakan untai ganda pada DNA dan mengaktifkan mekanisme perbaikan DNA. Selama proses perbaikan, nukleotida yang salah dapat dimasukkan, yang menyebabkan mutasi gen dan hilangnya fungsi (Zhang dkk., 2021a). Selain itu, versi enzim Cas12 yang lebih baik (disebut dCas12) juga digunakan untuk mengaktifkan gen. Dengan menggabungkannya dengan aktivator transkripsi, dimungkinkan untuk menginduksi gen tertentu, sehingga mengaktifkannya. Teknologi ini memiliki potensi besar dalam mendorong aktivasi gen penekan tumor (Sultan dkk., 2022).
Pengeditan primer adalah teknologi pengeditan genom yang baru dikembangkan dan sangat unggul. Teknologi ini mampu memodifikasi DNA suatu organisme dengan sangat tepat (Chen dan Liu, 2023). Pengeditan primer dicapai melalui integrasi dua komponen utama: enzim CRISPR/Cas9 yang dimodifikasi dan transkriptase balik. Peran enzim CRISPR/Cas9 adalah untuk secara selektif menargetkan situs-situs tertentu dalam genom, sementara transkriptase balik membantu memodifikasi DNA secara menyeluruh di lokasi target (Hassan dkk., 2021). Dalam mekanisme pengeditan primer, langkah pertama melibatkan pembuatan RNA pemandu pengeditan primer (pegRNA) (Standage-Beier dkk., 2021). RNA ini mengandung sekuens target dan templat RNA yang sesuai dengan situs pengeditan yang diinginkan dalam DNA target. PegRNA kemudian dimasukkan ke dalam sel target bersama dengan nuklease pengeditan primer (PE2). PE2 adalah protein fusi yang terdiri dari enzim Cas9, transkriptase balik, dan adaptor pengeditan primer (Martín-Alonso dkk., 2021). Di dalam sel, kompleks pegRNA dan PE2 mencari DNA spesifik yang ingin mereka modifikasi. Enzim Cas9 memotong DNA dan menciptakan templat yang terdiri dari untai tunggal (Choi dkk., 2022). Transkriptase balik menggunakan templat ini untuk mempersiapkan DNA untuk diedit. Bersamaan dengan penyalinan DNA, instruksi untuk mengedit templat RNA juga disertakan. Akhirnya, untai DNA yang baru dibuat digunakan sebagai templat untuk memperbaiki kerusakan pada DNA, menghasilkan urutan DNA yang diubah yang mengandung modifikasi yang diinginkan (Ochoa-Sanchez dkk., 2021). Mekanisme pengeditan primer dapat menyebabkan mutasi yang meluas pada gen. Mekanisme ini dapat menargetkan mutasi titik, insersi, delesi, dan bahkan penggantian gen (Anzalone dkk., 2019; Chen dan Liu, 2023). Pengeditan primer menawarkan beberapa keunggulan dibandingkan teknologi pengeditan genom sebelumnya. Hal ini termasuk peningkatan akurasi, pengurangan efek di luar target, dan kemampuan untuk mengedit DNA tanpa bergantung pada kerusakan untai ganda DNA (Anzalone et al., 2020).
Teknologi CRISPR/Cas9 awalnya dikembangkan untuk melindungi bakteri dari transfer plasmid dan infeksi fage, dan kemudian digunakan kembali sebagai alat penargetan DNA berbasis RNA yang efektif untuk pengeditan genom (Jiang dan Doudna, 2017). Selain itu, sistem CRISPR/Cas9 dilaporkan terdapat pada 50% dan 87% genom bakteri dan archaea, masing-masing (Ishino dkk., 2018). CRISPR/Cas9 merupakan alat potensial untuk penghapusan, penyisipan, dan koreksi sekuens genetik abnormal apa pun menggunakan metode in vivo dan in vitro (Sabit dkk., 2021). Lebih jauh lagi, CRISPR/Cas9 telah terbukti menjadi bagian dari sistem kekebalan adaptif karena spesifisitasnya terhadap gen target yang diinginkan (Chen dan Zhang, 2018).
CRISPR/Cas9 terdiri dari Cas9 dan RNA pemandu tunggal (sgRNA). Cas9 adalah endonuklease yang terdiri dari beberapa komponen protein. Selain itu, Cas9 memiliki sifat struktural dan konformasi yang unik (Pacesa et al., 2022) karena terdiri dari dua lobus: pengenalan (REC) dan nuklease (NUC). Lobus REC selanjutnya dibagi menjadi tiga wilayah: REC1, REC2, dan heliks jembatan (Cromwell et al., 2018). NUC terdiri dari tiga lobus, yaitu RuvC (RuvC I, RuvC II, RuvC III), HNH dan domain interaksi motif protospacer adjacent (PAM) (Gambar 1) (Song et al., 2016). sgRNA terdiri dari dua komponen, termasuk RNA CRISPR (crRNA) dan RNA kecil transkode (RNA pelacak) (Gambar 1). sgRNA menghubungkan protein Cas9 dengan connexin untuk membentuk kompleks aktif, yang juga dikenal sebagai kompleks efektor (Richter et al., 2012). crRNA adalah pasangan basa nukleotida 18–20 yang memainkan peran penting dalam mengenali sekuens DNA target. Selain itu, crRNA berpasangan dengan DNA target, dan tracrRNA bertindak sebagai perancah bagi nuklease Cas9 untuk mengikat DNA target (Manghwar et al., 2019). Di sisi lain, sekuens PAM memiliki 3 nukleotida, yang mengkonfirmasi, menentukan, dan memediasi pengikatan kompleks efektor ke DNA. Subunit kompleks protein Cas9 RuvC dan HNH memiliki aktivitas katalitik (Richter et al., 2012; Asmamaw dan Zawdie, 2021). Domain nuklease HNH dari subunit Cas9 membelah untai DNA yang terkait dengan crRNA. Domain nuklease RuvC membelah untai DNA lain dan menghasilkan kerusakan untai ganda (DSB), setelah itu dua mekanisme perbaikan kerusakan DNA yang berbeda diaktifkan (Jiang dan Doudna, 2017) (Gambar 1).
Gambar 1. Gambaran umum CRISPR/Cas9 (A). Komponen sistem CRISPR/Cas9: (i). Endonuklease Cas9 bertanggung jawab untuk memotong sekuens DNA target, (ii) RNA pemandu tunggal (sgRNA) yang dihasilkan dari fusi chimera crRNA dan tra-crRNA. (2). Cas9 mencakup beberapa komponen seperti Rec I, Rec II, lobus NUC (HNH dan Ruv C adalah subkomponen) dan domain interaksi PAM (C) dengan fungsi yang sesuai. Kompleks protein CRISPR/Cas9 membelah sekuens DNA menjadi bentuk non-komplementer dan komplementer (D). CRISPR/Cas9 mengedit genom dalam tiga tahap: pengenalan, pemotongan, dan perbaikan. sgRNA yang dirancang memandu Cas9 dan mengenali sekuens yang diinginkan melalui komponen komplementer crRNA. Cas9 mengenali sekuens PAM pada 5′-NGG-3′ dan melelehkan DNA, membentuk hibrida DNA-RNA dan mengaktifkan pemotongan. Domain HNH dari Cas9 membelah untai komplementer, dan domain RuvC membelah untai non-komplementer. CRISPR/Cas9 memperbaiki dsDNA dengan memecahnya melalui dua cara: penyambungan ujung non-homolog (NHEJ) dan perbaikan yang diarahkan homologi (HDR). NHEJ memperbaiki DNA untai ganda tanpa adanya DNA homolog asing melalui proses enzimatik, mekanisme yang rawan kesalahan yang dapat menyisipkan atau menghilangkan sekuens DNA acak. HDR sangat spesifik dan membutuhkan templat DNA homolog.
Jalur perbaikan yang dimediasi CRISPR/Cas9 meliputi mekanisme penyambungan ujung non-homolog (NHEJ) dan perbaikan yang diarahkan homologi (HDR). NHEJ merupakan jalur yang rawan kesalahan karena melibatkan penyisipan atau penghapusan dan tidak memerlukan pola apa pun selama mekanisme perbaikan. Ia menggunakan nukleotida acak untuk menghasilkan protein standar (Abbasi et al., 2021). Sistem perbaikan ini terdiri dari empat kompleks seperti kompleks KU, kompleks protein komplementasi silang tipe 4 (XRCC-4), enzim pemrosesan ujung DNA, dan protein kinase DNA-PKcs (Abbasi et al., 2021). Protein kompleks KU memiliki dua subunit, Ku 70 dan Ku 80, dan memainkan peran penting dalam mekanisme NHEJ, karena mekanisme perbaikan dimulai dengan pengikatan dua subunit (Ku 70 dan Ku 80) ke ujung tumpul atau hampir tumpul dari DNA target (Abbasi et al., 2021), berfungsi sebagai perancah untuk merekrut faktor-faktor terkait NHEJ lainnya ke lokasi cedera (Yang et al., 2020). XRCC-4 dan DNA ligase masing-masing terdiri dari 334 dan 911 asam amino, dan kompleks XRCC4-DNA ligase IV merangsang ligasi ujung DNA (Chatterjee et al., 2015). Enzim pemrosesan ujung DNA, juga dikenal sebagai polinukleotida kinase 3′-fosfat, adalah enzim pemrosesan ujung DNA. Enzim ini dapat menghilangkan gugus 3′P dalam DNA dan memfosforilasi gugus 5′OH selama perbaikan DSB. Hal ini juga melibatkan perbaikan kerusakan untai tunggal (SSB) menggunakan jalur perbaikan SSB (Chatterjee et al., 2015). Protein kinase DNA-PKcs adalah protein kinase yang bergantung pada DNA yang terdiri dari subunit katalitik dari keluarga PIKK (phosphatidylinositol 3-kinase-related kinases) dan ataxia telangiectasia mutated (ATM), serta ATM dan Rad3-related ATR. kerusakan untai ganda (DSB) dan kerusakan untai tunggal (Yue et al., 2020; Peng et al., 2016).
HDR merupakan mekanisme perbaikan yang lebih akurat dan sesuai karena informasi disalin menggunakan bentuk utuh dari dupleks DNA homolog, meskipun membutuhkan keberadaan kromatid saudara. Hal ini terjadi selama fase S/G2 dari siklus sel mamalia. HDR terutama terjadi pada spesies ragi, tetapi NHEJ sangat penting pada mamalia (Burma et al., 2006; Abbasi et al., 2021). Mekanisme perbaikan lengkap ditunjukkan pada Gambar 1.
Karena TNBC disebabkan oleh kelainan genetik dan epigenetik, koreksi kelainan genomik/epigenomik ganas menggunakan CRISPR/Cas9 mungkin merupakan pendekatan terapeutik yang masuk akal (Chen et al., 2019). Selain itu, beberapa faktor transkripsi yang terlibat dalam regulasi transkripsi spesifik sel dapat menunjukkan karakteristik unik sel kanker, menunjukkan bahwa regulasi transkripsi mungkin merupakan pendekatan yang sangat baik untuk pengobatan kanker (Drost et al., 2017). Memanfaatkan fitur molekuler tumor ini, seperti cacat genetik, epigenetik, dan transkripsi, untuk pengembangan obat dapat meningkatkan hasil klinis dan mengurangi biaya skrining. CRISPR adalah alat pengeditan gen potensial yang tidak hanya dapat mendeteksi dan mengidentifikasi target genomik penyebab kanker, tetapi juga dapat digunakan untuk mengedit, menekan, dan memodifikasi onkogen secara epigenetik pada sel manusia (Tabel 1) (Ahmed et al., 2021). Beberapa skrining CRISPR telah dilakukan untuk mencari gen yang terkait dengan penekan tumor, onkogen, dan resistensi obat. Penggunaan CRISPR/Cas9 untuk mengedit berbagai onkogen TNBC ditunjukkan pada Gambar 2.
Gambar 2. Pengeditan gen berbagai onkogen TNBC menggunakan CRISPR/Cas9 menghasilkan pengurangan pertumbuhan tumor dan metastasis. Onkogen ini meliputi CDK7, NAT1, UBR5, YTHDF2, ITGA9, CXCR4 dan CXCR7, Crypto1, ROR1 dan ST8SIA, yang terlibat dalam terjadinya dan metastasis TNBC.
Migrasi sel kanker, invasi, dan transisi epitel-mesenkimal (EMT) dikaitkan dengan ITGA9. Studi sebelumnya menunjukkan bahwa ITGA9 merupakan pemain kunci dalam jalur Notch dan memainkan peran penting dalam metastasis rhabdomyosarcoma (Molist dkk., 2020). Selain itu, ITGA9 ditemukan terkait erat dengan prognosis pasien pada beberapa jenis tumor, termasuk kanker payudara (Wang Z. dkk., 2019). Analisis bioinformatika ITGA9 juga menunjukkan bahwa ekspresinya pada TNBC secara signifikan lebih tinggi daripada subtipe kanker payudara lainnya. Peningkatan kadar ITGA9 dikaitkan dengan metastasis dan kekambuhan tumor pada pasien TNBC. Penghapusan ITGA9 dengan CRISPR/Cas9 menghasilkan sifat seperti sel induk kanker (CSC), angiogenesis tumor, pertumbuhan tumor, dan pengurangan metastasis dengan meningkatkan degradasi β-catenin pada TNBC (Wang Z. dkk., 2019).
Crypto-1 adalah anggota keluarga TGF-β dan sangat penting untuk embriogenesis awal, pemeliharaan sel punca, dan metastasis kanker (Ishii et al., 2021). Juga dikenal sebagai Tdgf-1, ini adalah protein pensinyalan berlabuh GPI onkogenik yang terlibat dalam pengaturan pembentukan garis primitif, mesoderm dan endoderm, serta pembentukan asimetri kiri/kanan dalam perkembangan organ tubuh selama embriogenesis (Zhang et al., 2021b). Selain itu, Crypto-1 telah terbukti terlibat dalam transisi epitel-mesenkimal (EMT) sebagai penanda sel punca (Zhang et al., 2021b). EMT sangat penting tidak hanya untuk berbagai proses seperti perkembangan embrio, fibrosis dan penyembuhan luka, tetapi juga untuk invasi dan metastasis kanker. Selain itu, Crypto-1 telah terbukti berinteraksi dengan empat reseptor Notch dan meningkatkan pematangan pasca-translasi mereka (Brandstadter dan Maillard, 2019). Jalur pensinyalan Notch diketahui terlibat dalam pemeliharaan sel kanker payudara manusia. Studi menunjukkan bahwa penonaktifan Crypto-1 melalui CRISPR/Cas9 menekan pertumbuhan dan metastasis kanker. Oleh karena itu, Crypto-1 dapat menjadi target terapi penting untuk TNBC (Castro dkk., 2015).
Protein XCL12 dan reseptor kemokinnya CXC (CXCR4 dan CXCR7) memainkan berbagai peran dalam proliferasi, pertumbuhan, migrasi, dan invasi sel kanker (Wu et al., 2015). Kemoreseptor ini telah dikaitkan dengan perkembangan TNBC melalui berbagai jalur pensinyalan baik dalam model in vivo maupun in vitro (Wu et al., 2015). Selain itu, aktivasi CXCR4 dan CXCR7 dikaitkan dengan kerentanan yang lebih besar terhadap metastasis dan prognosis yang buruk pada TNBC (Karn et al., 2022). Oleh karena itu, penghapusan CXCR4 dan CXCR7 dapat menjadi gen target obat yang efektif untuk pengobatan kanker payudara, termasuk TNBC. Studi oleh Yang et al. Yang et al (2019) menggunakan CRISPR/Cas9 untuk melakukan ko-knockout gen CXCR4 dan CXCR7 dan menemukan bahwa proliferasi, pertumbuhan, migrasi, dan invasi TNBC terhambat secara signifikan (Yang et al., 2019).
Peningkatan kadar miR-3662, onkogen TNBC, diamati pada jaringan kanker payudara (Yi dkk., 2022). Penurunan ekspresi miR-3662 telah terbukti menghambat pertumbuhan dan metastasis tumor kanker payudara baik secara in vivo maupun in vitro (Agarwal dan Gupta, 2021). HBP-1 merupakan penghambat kuat sinyal Wnt/-catenin dan kemungkinan bertanggung jawab atas pertumbuhan sel TNBC yang dimediasi oleh miR-3662. Baru-baru ini, Yi dkk. menemukan bahwa sumbu miR-3662-HBP1 mengatur jalur sinyal Wnt/-catenin pada sel TNBC (Yi dkk., 2022). Karena ekspresinya yang spesifik terhadap tumor, miR-3662 mungkin merupakan target terapi potensial untuk TNBC. Dengan demikian, penurunan ekspresi miR-3662 yang dimediasi CRISPR/Cas9 mungkin merupakan pendekatan yang sangat baik untuk mengembangkan obat baru untuk pengobatan TNBC.
UBR5 adalah nukleofosfoprotein 300 kDa yang telah diidentifikasi sebagai regulator kunci tumorigenesis, metastasis, dan respons imun pada berbagai kanker (Shearer et al., 2015; Fu et al., 2023). UBR5 dilaporkan mengalami peningkatan ekspresi yang tinggi pada sampel TNBC dan menstimulasi fungsi ERα dengan menginduksi proliferasi melalui aktivitas ubiquitin ligase-nya (Bolt et al., 2015). Studi pengurutan seluruh genom pada sampel TNBC primer juga menunjukkan peningkatan ekspresi UBR5, yang menunjukkan perannya dalam perkembangan TNBC. Selain itu, penghapusan UBR5 yang didorong oleh CRISPR/Cas9 menunjukkan penghambatan signifikan metastasis dan pertumbuhan TNBC pada model tikus percobaan. Lebih lanjut, inklusi UBR5 pada model tikus tipe liar mengembalikan fungsionalitas penuhnya, sedangkan efek ini tidak diamati pada strain mutan yang dinonaktifkan (Liao et al., 2017). Kekurangan UBR5 dikaitkan dengan peningkatan apoptosis, nekrosis, dan penghambatan pertumbuhan tumor pada TNBC karena angiogenesis yang buruk. Karena hilangnya UBR5, penyebaran tumor ke organ jauh berkurang, dan UBR5 menginduksi EMT abnormal terutama dengan mengurangi ekspresi E-cadherin (Zhang dan Weinberg, 2018). Baru-baru ini, UBR5 terbukti menjadi faktor yang sangat penting dalam transkripsi PDL1 yang diinduksi IFN-γ pada TNBC karena kurangnya aktivitas ubikuitinasi E3. Analisis transkriptom RNA mengungkapkan bahwa UBR5 mungkin memiliki efek sistemik pada gen yang terkait dengan jalur IFN-γ dan mendorong transaktivasi PDL1 dengan meningkatkan tingkat aktivasi protein kinase RNA (PKR) dan transduktor sinyal serta aktivator transkripsi 1 (STAT1) dan faktor pengatur interferon 1 (IRF1). Namun, ablasi gabungan ekspresi UBR5 dan PD-L1 yang dimediasi CRISPR/Cas9 memiliki efek terapeutik sinergis dibandingkan dengan penghambatan tunggal, dengan efek mendalam pada lingkungan mikro tumor (Wu et al., 2022). Dengan demikian, CRISPR/Cas9 dapat menjadi alat penting untuk menghambat fungsi UBR5, sehingga menekan metastasis TNBC dan pertumbuhan tumor.
ROR1 adalah protein transmembran tipe I yang diekspresikan selama perkembangan kanker dan embrio, dan telah diidentifikasi sebagai protein onkofetal (Nicholas Borcherding, 2014). Perilaku invasif berbagai kanker manusia dikaitkan dengan peningkatan ekspresi ROR1. Hasil yang menjanjikan telah diperoleh dari studi in vivo dan in vitro yang melibatkan senyawa terapeutik yang menargetkan ROR1 (Chien dkk., 2016). Peningkatan kadar mRNA ROR1 dalam biopsi jaringan payudara juga telah dikaitkan dengan tumor payudara basal-like (BL) yang agresif dan migrasinya ke bagian tubuh lain. Selain itu, ekspresi berlebihan ROR1 telah diidentifikasi sebagai penanda prognostik untuk perkembangan TNBC (Chien dkk., 2016). Namun, membungkam ROR1 menggunakan CRISPR/Cas9 untuk menekan pertumbuhan dan metastasis TNBC akan menjadi strategi yang efektif.
Proses sialilasi melibatkan penambahan asam sialat ke glikokonjugat, yang dikatalisis oleh sialiltransferase (ST). ST8SIA1 termasuk dalam keluarga ST dan memainkan peran penting dalam patogenesis berbagai penyakit seperti leukemia limfositik dan kanker kolorektal (Chang et al., 2018). Analisis sekuens RNA menunjukkan bahwa ST8SIA1 diekspresikan secara tinggi pada jaringan payudara pasien TNBC dan berkorelasi positif dengan mutasi pada gen penekan tumor p53, yang dapat berkontribusi pada patogenesis TNBC (Battula et al., 2017). Selain itu, ST8SIA1 terlibat dalam metastasis dan kekambuhan TNBC, menunjukkan bahwa ia memainkan peran penting dalam terjadinya dan perkembangan TNBC. Dalam model in vitro TNBC, penekanan ekspresi ST8SIA1 oleh CRIPSR/Cas9 terbukti menghambat pertumbuhan dan metastasis (Battula et al., 2017). Hal ini menunjukkan bahwa CRISPR/Cas9 mungkin merupakan alat penting untuk menghambat fungsi onkogen ST8SIA1 dalam pengobatan TNBC.
NAT1 adalah enzim metabolik yang mengkatalisis pembentukan senyawa xenobiotik fase II dan diekspresikan di hampir semua jaringan manusia. NAT1 dapat menggunakan kofaktor folat untuk menargetkan asetil-CoA (asetil-CoA) bahkan tanpa adanya substrat amina aromatik (Stepp et al., 2015; Laurieri et al., 2014). Studi menunjukkan bahwa NAT1 mengatur fungsi matriks metalloproteinase 9 (MMP9) dalam model sel kanker payudara dan melindungi terhadap spesies oksigen reaktif (ROS) selama kelaparan glukosa (Wang et al., 2018). Penghapusan NAT1 telah terbukti menghambat kompleks piruvat dehidrogenase, yang menyebabkan disfungsi mitokondria (Wang L. et al., 2019). Selain itu, berbagai laporan lain menunjukkan bahwa penghambatan NAT1 menggunakan molekul kecil dan pen silencing siRNA dapat mengurangi invasivitas dan proliferasi sel kanker payudara (Stepp et al., 2018). Baru-baru ini, CRISPR/Cas9 digunakan untuk menekan NAT1 pada sel kanker payudara MDA-MB-231, yang memengaruhi metabolisme sel tergantung pada tingkat ekspresinya. Studi ini juga menunjukkan bahwa NAT-1 sangat penting untuk perkembangan dan metastasis TNBC (Carlisle et al., 2020).
Transkripsi onkogen yang terkoordinasi diatur oleh super enhancer, faktor transkripsi, dan kofaktor (Hnisz et al., 2015). Selain itu, sekelompok kinase dependen siklin (CDK), seperti CDK7, CDK8, CDK9, CDK12, dan CDK13, diperlukan untuk regulasi transkripsi. Di antara mereka, CDK7 terlibat dalam fosforilasi RNA polimerase II, yang sangat penting untuk inisiasi dan perluasan transkripsi onkogen dalam patogenesis TNBC. Dalam sebuah studi penting, penghapusan CDK7 dengan CRISPR/Cas9 menghambat TNBC, menunjukkan bahwa patogenesis TNBC bergantung pada CDK7 (Wang Y. et al., 2015).
Penelitian menunjukkan bahwa mutasi pada MYC dan RBP (protein pengikat RNA) dapat menyebabkan apoptosis, sementara mutasi gen tunggal pada MYC atau RBP tidak memengaruhi pertumbuhan sel kanker (Einstein dkk., 2021). Lebih dari 1000 RBP dalam genom manusia telah disaring menggunakan pustaka berbasis CRISPR/Cas9. Di antaranya, 57 RBP ditemukan penting untuk pertumbuhan sel kanker dengan kadar MYC yang sangat tinggi (Wheeler dkk., 2020). Selain itu, YTHDF2 penting untuk mempertahankan pertumbuhan sel TNBC dan mengurangi jumlah transkrip termetilasi selama transkripsi dan translasi tingkat tinggi pada sel kanker dengan ekspresi MYC yang lebih tinggi. Selanjutnya, YTHDF2 tidak penting untuk sel kanker yang kurang bergantung pada peningkatan kadar MYC untuk memperpanjang kelangsungan hidup pasien TNBC (Einstein dkk., 2021), menunjukkan bahwa YTHDF2 mungkin merupakan target terapi potensial untuk obat-obatan yang dapat mengatasi TNBC.
Protein zinc finger (ZNF) membentuk sekitar 1% dari total genom manusia. Studi telah menunjukkan bahwa ZNF dapat mengatur proliferasi sel pada berbagai kanker, seperti kanker hati, kanker payudara, dan kanker kolorektal (Zhang W. dkk., 2021; Li dkk., 2017). Pustaka yang dihasilkan oleh knockout CRISPR telah digunakan untuk menyaring berbagai gen penekan tumor (TSG) pada sel kanker payudara (Shalem dkk., 2014). Sejak itu, studi transkriptomik sel kanker payudara yang mengalami penghapusan ZNF319 menggunakan CRISPR/Cas9 telah menunjukkan bahwa ZNF319 adalah gen penekan tumor yang mengurangi proliferasi kanker payudara dan oleh karena itu terlibat dalam berbagai mekanisme pensinyalan potensial dan fungsi biologis lainnya (Wang L. dkk., 2022).
Ferroptosis adalah jenis kematian sel terprogram yang bergantung pada keberadaan zat besi. Diketahui bahwa perkembangan ferroptosis dipengaruhi oleh keberadaan peroksida lipid. Selain itu, PKCβII dilaporkan menunjukkan peroksidasi lipid dini, dan peningkatan peroksidasi lipid dikaitkan dengan ferroptosis. Penyaringan pustaka inhibitor kinase yang dimediasi CRISPR/Cas9 mengungkapkan bahwa PKCβII terlibat dalam proses peroksidasi lipid, yang sangat penting untuk ferroptosis pada sel MDA-MB-231 (Zhang dkk., 2022). Oleh karena itu, hal ini menunjukkan bahwa penghapusan PKCβII dengan CRISPR/Cas9 mungkin merupakan target gen penekan tumor potensial untuk pengobatan penyakit yang berhubungan dengan ferroptosis (Zhang dkk., 2022).
Resistensi obat diyakini bertanggung jawab atas sekitar 90% kematian pada pasien kanker dan merupakan salah satu tantangan utama dalam pengobatan kanker (Bukowski dkk., 2020). Hasil penelitian menunjukkan bahwa sejumlah gen yang berkaitan dengan pengeluaran obat, perbaikan DNA, apoptosis, dan berbagai jalur pensinyalan sel terkait dengan resistensi obat (Haider dkk., 2020). Di antara gen-gen tersebut, beberapa gen telah ditargetkan oleh alat CRISPR/Cas9 dan telah menunjukkan hasil yang menjanjikan dalam mengurangi resistensi obat dan meningkatkan efektivitas pengobatan antikanker (Vaghari-Tabari dkk., 2022). Selain itu, pustaka penyaringan penonaktifan gen CRISPR/Cas9 berkapasitas tinggi telah terlibat dalam memodifikasi fungsi target gen resistensi obat potensial (Shalem dkk., 2015). Untuk mengidentifikasi gen resistensi paclitaxel, sekuensing RNA yang dikombinasikan dengan penyaringan pustaka sgRNA di seluruh genom digunakan untuk mengidentifikasi delapan gen kandidat, termasuk histone deacetylase 9 (HDAC9), yang terkait dengan resistensi obat pada pasien dengan TNBC rekuren (B et al., 2020). Dalam studi lain, peningkatan ekspresi diserine/threonine dan tyrosine protein kinase (DSTYK) diamati selama kelangsungan hidup pasien TNBC yang diobati dengan obat antikanker. Selain itu, knockdown DSTYK yang dimediasi CRISPR/Cas9 secara signifikan meningkatkan apoptosis sel kanker resisten obat secara in vitro (sel SUM102PT dan sel MDA-MB-468) dan model TNBC in vivo (Ogbu et al., 2021).
Meskipun TNBC memiliki aktivasi abnormal jalur MAPK, efek klinis terapi yang menargetkan MEK kurang baik. Sebuah skrining pustaka genom CRISPR/Cas9 mengungkapkan bahwa penghambatan PSMG2 (proteome assembly chaperone 2) membuat sel TNBC BT549 dan MB468 lebih sensitif terhadap inhibitor MEK AZD6244. Penurunan ekspresi PSMG2 menggunakan CRISPR/Cas9 mengubah fungsi proteasom normal, yang menyebabkan pembongkaran PDPK1 yang dimediasi autofagi, sehingga semakin meningkatkan sel tumor pada model tikus TNBC yang diinduksi oleh AZD6244 (inhibitor MEK) dan MG132 (inhibitor proteasom). Dengan demikian, inhibitor proteasom dan MAP kinase (MEK) dapat diberikan secara sinergis untuk mengurangi proliferasi sel tumor (Wang X. dkk., 2022).
CRISPR/Cas9 juga telah digunakan untuk menyaring hilangnya fungsi gen yang menyebabkan resistensi TNBC (Shu et al., 2020). Ge et al menjelaskan mekanisme resistensi obat sel kanker yang diobati dengan JQ1, inhibitor bromodomain BET (BBDI), pada TNBC. Dengan menggunakan CRISPR/Cas9, mereka menemukan bahwa penghapusan gen rb1 menyebabkan TNBC menjadi resisten terhadap obat antikanker JQ1. Oleh karena itu, fungsi rb1 penting dalam respons terhadap obat JQ1 pada TNBC. Mereka juga melaporkan bahwa paclitaxel adalah inhibitor kinase/mikrotubulus CDK4/6, dan kombinasinya dengan BBDI seperti JQ1 dapat memberikan respons terapeutik yang menjanjikan terhadap TNBC yang resisten terhadap obat (Ge et al., 2020).
Lanskap transkripsi RNA non-pengkode panjang (lncRNA) telah dilaporkan bertanggung jawab atas resistensi terhadap terapi neoadjuvan pada TNBC. Studi ini menunjukkan bahwa lima transkrip lncRNA MALAT1 yang berbeda diekspresikan secara tinggi pada TNBC. Selain itu, penghapusan MALAT1 yang dimediasi CRISPR/Cas9 meningkatkan sensitivitas sel TNBC BT-549 terhadap paclitaxel dan doxorubicin, menunjukkan potensi peran resistensi MALAT1 pada TNBC (Shaath dkk., 2021).
Mutasi pada BRCA1 (BRCA1m) bersifat heterogen dan oleh karena itu sulit dideteksi. Menargetkan PARP1 (poli(ADP-ribosa) polimerase), mitra letal sintetik dari BRCA1, dapat meningkatkan kemosensitivitas obat TNBC. Dengan menggunakan CRISPR/Cas9, penghapusan PARP1 meningkatkan sensitivitas obat antikanker seperti doxorubicin, gemcitabine, dan docetaxel pada sel TNBC mutan mBRCA1, menunjukkan bahwa PARP1 juga terlibat dalam resistensi obat pada TNBC (Vaghari-Tabari dkk., 2022). Mutasi pada gen penekan tumor BRCA1 atau BRCA2 diketahui meningkatkan kemungkinan berkembangnya kanker payudara pada manusia. Pengobatan pasien ini memerlukan penggunaan inhibitor PARP. Selain itu, telah ditunjukkan bahwa penghapusan faktor penyelamatan nukleotida DNPH1 menggunakan CRISPR/Cas9 dapat menghilangkan nukleotida toksik 5-hidroksimetildeoksiuridin (hmdU) monofosfat, sehingga meningkatkan respons sel yang kekurangan BRCA terhadap sensitivitas terhadap penghambat PARP (Fugger et al., 2021). Dengan demikian, CRISPR/Cas9 dan penghambat PARP1 dapat menjadi strategi pengobatan penting untuk TNBC.
Gen glikoprotein penetran (P-gp) adalah gen resistensi multidrug yang umumnya mengalami peningkatan ekspresi pada sekitar 41% dari semua TNBC (Sun et al., 2020). Pengeluaran obat yang diinduksi P-gp telah diidentifikasi sebagai regulator kunci resistensi obat pada kanker payudara. Inhibitor P-gp telah menunjukkan peningkatan sensitivitas terhadap obat antikanker pada kanker payudara (Famta et al., 2021). Dengan demikian, ablasi atau penekanan P-gp dan inhibitor P-gp yang dimediasi CRISPR/Cas9 mungkin merupakan metode yang sangat penting untuk mengatasi resistensi obat pada TNBC.
Transporter kaset pengikat ATP G2 (ABCG2) diketahui menyebabkan resistensi obat pada TNBC (Palasuberniam dkk., 2015), meskipun saat ini belum ada laporan tentang hubungan antara CRISPR/Cas9 dan penonaktifan ABCG2 serta inaktivasi gen penekan tumor. PTEN dapat meningkatkan aktivasi ABCG2 (Palasuberniam dkk., 2015), (Deepak Singh dkk., 2021). Oleh karena itu, penggunaan CRISPR/Cas9 untuk menghilangkan ABCG2 dan menggabungkannya dengan inhibitor ABCG2 mungkin merupakan pengobatan yang tepat untuk mengatasi resistensi obat pada TNBC. Tabel 2 menyebutkan CRISPR/Cas9 yang menargetkan semua gen resistensi.
Tabel 2. CRISPR/Cas9 menargetkan berbagai gen resistensi TNBC untuk meningkatkan sensitivitas sel terhadap obat antikanker.
Pustaka CRISPR/Cas9 merupakan alat potensial untuk menyaring mutasi gen yang terkait dengan patogenesis kanker (Chan et al., 2022). Metode penyaringan ini melibatkan empat langkah, yaitu (a) pembuatan pustaka, (b) transduksi lentivirus, (c) penyaringan fenotip, dan (d) analisis gen target. Meskipun TNBC memiliki aktivasi abnormal jalur MAPK, prognosis klinis terapi target MEK untuk pasien TNBC yang membawa mutasi pada gen penekan tumor seperti PTEN, RB1, dan TP53 sangat buruk.
Selain itu, skrining penghapusan gen menggunakan CRISPR/Cas9 menguji molekul yang paling ampuh dan selektif, dehidrokatrol, yang melimpah dalam ekstrak bunga dan daun Guatemala, untuk memahami efek dehidrokatrol pada MDA-MB-231. Mekanisme sitotoksisitas sel selektif. Karakteristik stemness mesenkimal dari subtipe TNBC. Skrining berbasis CRISPR/Cas9 ini juga mengungkapkan bahwa HSD17B11, gen yang mengkode 17β-hidroksisteroid dehidrogenase tipe 11, diekspresikan secara tinggi dalam sel MDA-MB-231 dan menghasilkan dehidrofalkarinol yang spesifik untuk sel MDA-MB-231 (Grant et al., 2020). Dengan demikian, ini menunjukkan bahwa skrining genomik CRISPR/Cas9 memiliki potensi besar dalam mengidentifikasi mekanisme yang mendasari sifat antikanker dari senyawa alami potensial.
Selain itu, kerentanan TNBC terhadap kanker dipelajari menggunakan skrining CRISPR/Cas9 in vivo genomik yang tidak bias, yang menunjukkan hubungan antara jalur onkogenik dan penekan tumor. Komponen kunci dari jalur mTOR dan Hippo dilaporkan memainkan peran penting dalam regulasi tumor pada TNBC. Selain itu, penelitian telah menunjukkan bahwa penghambatan farmakologis onkoprotein mTORC1/2 dan YAP secara efektif menghambat patogenisitas TNBC menggunakan model sinergi obat-matriks in vitro dan xenograft turunan pasien in vivo. Lebih lanjut, penghambatan mTORC1/2 yang dimediasi Torin-1 meningkatkan makropinositosis, sedangkan penghambatan YAP yang diinduksi verteporfin menyebabkan kematian sel TNBC. Secara keseluruhan, hasil ini menyoroti kekuatan dan ketahanan skrining CRISPR in vivo genomik untuk mengidentifikasi pengobatan baru dan efektif untuk TNBC (Dai dkk., 2021).
Disregulasi sistem imun merupakan faktor penting dalam tumorigenesis. Sel kanker menghindari pembersihan imun dengan melewati mekanisme pertahanan, termasuk mengganggu aktivitas sel imun di lingkungan mikro tumor dan melemahkan sistem imun. Oleh karena itu, mengembangkan sistem imun yang lebih baik mungkin merupakan pendekatan kunci untuk melawan tumor. Penggunaan modifikasi gen berbasis CRISPR/Cas9 mengatasi beberapa masalah terkait disfungsi imun dari berbagai perspektif. CRISPR/Cas9 telah digunakan untuk meningkatkan imunitas antitumor terhadap kanker payudara melalui jalur berikut (Gambar 3).
Gambar 3. Imunoterapi CRISPR/Cas9 menargetkan sel TNBC. Hilangnya CDK5 dan penurunan ekspresi PDL1 dan CD155 meningkatkan sistem kekebalan tubuh. Demikian pula, hilangnya A2AR dan penurunan ekspresi TAA seperti HER2, mucin 1, dan TEM8 meningkatkan efisiensi sel CAR-T dalam membunuh sel kanker. Penyaringan sel T yang didorong oleh CRISPR/Cas9 telah menunjukkan bahwa gangguan kinase p38 meningkatkan aktivitas antitumor sel T. Sel T yang dimodifikasi oleh CRISPR/Cas9 meningkatkan ekspresi TCR (reseptor sel T), sehingga sel T memiliki aktivitas antitumor.
Tujuan imunoterapi adalah untuk menstimulasi sistem kekebalan tubuh agar menyerang sel kanker. Ekspresi berlebihan protein checkpoint imun biasanya mencegah reaksi autoimun tetapi dapat membantu kanker menghindarinya (Topalian dkk., 2015). Protein-protein ini mencegah reaksi imun dengan mengikat reseptor pada permukaan sel imun. Beberapa protein checkpoint (seperti CD155 dan PD-L1) menargetkan reseptor PD-1 pada sel imun dan diekspresikan pada kanker payudara, terutama TNBC (Li Y.-C. dkk., 2020). Penurunan ekspresi PD-L1 atau reseptornya menggunakan CRISPR/Cas9 dapat menstimulasi sistem kekebalan tubuh untuk menyerang tumor TNBC (Yahata dkk., 2019). Selain itu, penurunan ekspresi PD-L1 melalui penghapusan CDK5 yang dimediasi CRISPR/Cas9 telah terbukti menghambat pertumbuhan tumor secara in vitro dan in vivo (Deng dkk., 2020). Penghambatan pertumbuhan pada model kanker payudara in vitro dan in vivo menunjukkan bahwa pengurangan CD155 yang dimediasi shRNA mungkin memiliki efek terapeutik pada kanker payudara (Gao et al., 2018).
Sel T CAR mengekspresikan CAR yang mengenali antigen terkait tumor (TAA) dan dapat menggunakan penonaktifan protein checkpoint untuk meningkatkan aktivitasnya (Li C. dkk., 2020). Terdapat berbagai target potensial untuk terapi sel T CAR pada kanker payudara, termasuk beberapa TAA seperti HER2, mucin1, dan TEM8 (Bajgain dkk., 2018). Terdapat bukti bahwa sel T CAR yang menargetkan mesothelin (diekspresikan secara berlebihan pada sel TNBC BT-459) lebih efektif melawan kanker ketika PD-1 dinonaktifkan menggunakan CRISPR/Cas9 (Hu dkk., 2019). Namun, mengisolasi sel T dari pasien dan kemudian mengeditnya secara ex vivo merupakan proses yang membutuhkan banyak tenaga dan waktu. Meskipun sel T universal dapat mengurangi persyaratan isolasi, sel T donor yang mengekspresikan antigen leukosit manusia (HLA) kelas I dan reseptor sel T (TCR) harus dihilangkan untuk mencegah kelainan graft-versus-host (Ren dkk., 2017). (2017a). Dengan menggunakan CRISPR/Cas9, HDR dapat secara simultan menghilangkan TCR dan HLA serta menonaktifkan gen yang mengkode CAR. Studi menunjukkan bahwa CRISPR/Cas9 dapat digunakan untuk memasukkan CAR anti-CD19 ke dalam lokus TCR, sehingga secara efisien menghasilkan CAR tanpa mengurangi sel T (Dimitri dkk., 2022). Teknologi multipleks telah dikembangkan untuk menghasilkan sel T CAR alogenik dengan secara simultan menghilangkan TCR, beta-2-mikroglobulin (B2M), subunit HLA-I dan protein lain seperti PD-1 dan CTLA-4, yang mungkin memiliki sifat antikanker yang lebih besar terhadap TNBC (Eyquem dkk., 2017; Liu dkk., 2017; Ren dkk., 2017b; Dimitri dkk., 2022).
Penggunaan CRISPR/Cas9 dapat meningkatkan efektivitas sel CAR-T. Adenosin diketahui memiliki sifat imunosupresif dan dapat mengurangi imunitas antikanker dengan memblokir fungsi sel T dan mengaktifkan reseptor adenosin A2A (A2AR) (Vigano dkk., 2019). Pembisuan A2AR menggunakan CRISPR/Cas9 secara signifikan meningkatkan efikasi sel CAR-T in vivo (Giuffrida dkk., 2021). Sel T diketahui menunjukkan berbagai karakteristik fenotipik seperti ekspansi seluler, diferensiasi, stres oksidatif, dan stres genomik. Penyaringan sel T berbasis CRISPR/Cas9 mengungkapkan gangguan pada 25 kinase reseptor sel T yang berbeda. Di antaranya, penghapusan kinase p38 telah terbukti meningkatkan aktivitas antitumor sel T, menunjukkan bahwa kinase p38 adalah regulator kunci regulasi sel CAR-T (Gurusamy dkk., 2020).
Sel T dapat dimodifikasi secara genetik menggunakan CRISPR/Cas9 untuk menghasilkan TCR yang diekspresikan secara tinggi. Transfer sel T yang dimodifikasi secara genetik ke pasien telah menunjukkan aktivitas antikanker yang lebih kuat daripada sel T endogen. Oleh karena itu, TCR endogen dapat bersaing dengan TCR yang diubah secara genetik pada pasien, yang dapat memengaruhi potensi imunoterapi kanker. Untuk mengatasi masalah ini, penggunaan CRISPR/Cas9 untuk menghilangkan TCR-β endogen pada sel penerima dan kemudian mentransfer sel T TCR-β ke pasien kanker dapat menunjukkan respons imun antikanker yang lebih baik tanpa perlu adanya persaingan seksual TCR endogen (Fan dkk., 2018). Dengan demikian, kecuali sel T yang dimodifikasi CRISPR, TCR seribu kali lebih sensitif terhadap antigen tumor daripada sel T yang ditransduksi TCR normal. Selain itu, pada berbagai leukemia, sel T yang diubah yang dihasilkan oleh γδ TCR+ CRISPR menunjukkan ekspresi sel T CD4+ dan CD8+ yang lebih tinggi daripada transfer TCR standar (Legut dkk., 2018). Dengan demikian, sel T yang dimodifikasi yang dihasilkan oleh CRISPR/Cas9 mungkin merupakan metode imunoterapi yang efektif untuk mengatasi TNBC.
Integrin adalah molekul adhesi sel yang terdapat pada transmembran sel dan mendorong pengikatan sel ke matriks ekstraseluler (ECM) (Hamidi dan Ivaska, 2018). Disregulasi integrin dikaitkan dengan perkembangan dan migrasi kanker dengan mengubah matriks ekstraseluler, yang menyebabkan kelangsungan hidup sel kanker dalam sirkulasi (Hamidi dan Ivaska, 2018). Penurunan ekspresi integrin yang dimediasi CRISPR/Cas9 memperlambat perkembangan tumor, metastasis, dan kolonisasi pada TNBC. Penurunan ekspresi integrin a5 (ITGA5) telah dilaporkan mengurangi migrasi dan perkembangan sel pada kanker lain seperti kanker paru-paru (Ju dkk., 2017), menunjukkan bahwa integrin a5 mungkin juga merupakan faktor kunci dalam patogenesis TNBC.
Menghasilkan tikus knockout menggunakan metode sel punca embrionik (ES) tradisional adalah proses yang membutuhkan banyak tenaga, waktu, dan tidak efisien. Dibutuhkan berbulan-bulan dan bertahun-tahun untuk menargetkan sel ES melalui rekombinasi homolog, membiakkan tikus chimeric, dan kemudian menyilangkannya dengan tikus heterozigot untuk menghasilkan keturunan homozigot. Persilangan kompleks diperlukan untuk menciptakan tikus dengan banyak mutasi genetik. Namun, banyak masalah muncul ketika menggunakan tikus yang dihasilkan dengan ablasi sel ES menggunakan CRISPR/Cas9 atau dengan menyuntikkan komponen CRISPR/Cas9 ke dalam sel telur yang telah dibuahi. Misalnya, pengenalan perubahan sering terjadi pada lokus bialelik dan tidak spesifik gen. Baru-baru ini dilaporkan bahwa sel ES menggunakan teknologi CRISPR/Cas9 dapat secara simultan memasukkan mutasi bialelik hingga 5 gen (Nishizono et al., 2021). Untuk tujuan ini, mRNA Cas9 dan lima gRNA spesifik gen secara simultan ditransfeksikan ke dalam sel ES. Hal ini menyoroti janji dan efektivitas prosedur ini, meskipun mutasi ini mungkin telah diturunkan ketika galur pendiri dikembangbiakkan untuk menghasilkan tikus knockout lima kali lipat. Studi ini juga melaporkan penemuan yang mengejutkan: sel ES tidak lagi diperlukan untuk membuat tikus yang dimodifikasi secara genetik. Sebaliknya, untuk menghilangkan produk gen tertentu, mRNA Cas9 dan gRNA disuntikkan ke dalam embrio tahap sel tunggal. Akibatnya, galur pendiri knockout telah dibuat yang secara teoritis dapat digunakan untuk mempelajari konsekuensi penghapusan gen pada tikus (Qin dkk., 2016). Dengan demikian, CRISPR/Cas9 memungkinkan pembuatan tikus transgenik untuk mengobati TNBC dengan biaya lebih rendah daripada rekayasa genetika tradisional. Dengan menggunakan sistem CRISPR/Cas, model tikus knockout baru telah dikembangkan yang dapat berhasil memperkenalkan mutasi titik pada satu atau lebih gen endogen pada TNBC. Berdasarkan konsep ini, model hewan TNBC juga dapat dikembangkan menggunakan penghapusan BRCA1 dan p53 yang dimediasi CRISPR/Cas9, yang mengakibatkan hilangnya perbaikan HR, ketidakstabilan genomik, dan fenotipe mutan (Annunziato et al., 2020).
Saat ini, berbagai metode seperti mammografi, pencitraan resonansi magnetik (MRI), dan USG digunakan untuk mendiagnosis TNBC. Namun, metode-metode ini memiliki beberapa keterbatasan. Mammografi digunakan untuk mendiagnosis jaringan payudara lokal, bukan metastasis, di mana sel kanker telah bermigrasi ke organ lain. Ultrasonografi bukanlah metode yang dapat diandalkan untuk mendiagnosis TNBC (Chen dan Lee-Felker, 2023). MRI memiliki sensitivitas yang lebih tinggi daripada USG dan mammografi, tetapi akurasi diagnostiknya terbatas (Sha dan Chen, 2022). Biopsi jaringan adalah cara invasif untuk mengidentifikasi sel kanker. Namun, dalam beberapa kasus, biopsi dapat melewatkan jaringan kanker jika jarum melenceng dari area yang diinginkan. Selain itu, biopsi sangat mahal dan dapat menimbulkan trauma bagi pasien. TNBC adalah jenis kanker yang heterogen, sehingga biopsi mungkin tidak memberikan informasi yang cukup tentang jenis kanker. Oleh karena itu, metode diagnostik baru yang andal untuk mendeteksi TNBC sangat dibutuhkan. CRISPR/Cas9 dapat berfungsi sebagai alternatif yang sangat sensitif dan minimal invasif untuk diagnosis kanker payudara. Untuk tujuan ini, strategi berbasis CRISPR/Cas9 dapat digunakan untuk meningkatkan metode PCR untuk diagnosis TNBC. Pertama, protein Cas9 dan cpf1 dari sistem CRISPR digunakan untuk menghilangkan DNA non-spesifik, dan kemudian kedua protein ini (Cas9 dan cpf1) dapat mengenali sekuens PAM sebelum berikatan dengan DNA target (Deepak Singh dkk., 2021). Dengan demikian, PCR dapat mengidentifikasi mutasi yang terkait dengan perkembangan kanker. Beberapa penelitian telah mengadopsi strategi berbasis CRISPR ini untuk mendeteksi berbagai mutasi pada berbagai jenis kanker (Safari dkk., 2019). Dengan demikian, metode PCR berbasis CRISPR dapat mengurangi ketergantungan diagnosis TNBC pada metode invasif seperti imunohistokimia berbasis biopsi.
Perubahan genotip dalam regulasi reseptor hormon juga telah ditunjukkan pada TNBC (Chen dan Russo, 2009). Strategi PCR berbasis CRISPR/Cas9 menggunakan mikroarray untuk diagnostik di tempat perawatan dapat secara efektif memantau mutasi ini (Hajian dkk., 2019). Hal ini juga dapat memberikan informasi yang relevan kepada penyedia layanan kesehatan tentang mutasi spesifik pada pasien TNBC, yang dapat membantu meningkatkan pengobatan mereka. Namun, teknik gabungan ini memiliki keterbatasan. Oleh karena itu, diperlukan upaya penelitian yang ekstensif sebelum metode CRISPR/Cas-PCR ini dapat digunakan dalam perawatan kesehatan untuk diagnosis TNBC (Yang dkk., 2019).